论文部分内容阅读
柴胡是我国著名大宗药材,以根入药,药用价值极高,化学活性成分复杂丰富,其中柴胡皂苷是柴胡类抗炎药的主要药效成分,其在侧根中含量显著高于主根中含量。近年来,使用基于生物技术的育种方法已成为选育药用植物最新方向之一,而农杆菌介导的基因转化是直接依赖于植物组织培养的主要生物技术育种方法。本课题组前期对北柴胡中侧根形成相关基因进行克隆研究后发现,生长素响应基因(auxin-responsive,AUX/IAA)家族中的BcIAA13在侧根形成前后表达量的变化趋势一致,侧根形成后表达量逐渐降低,推测BcIAA13参与调控北柴胡侧根发生发育的过程。本研究以北柴胡叶片、茎段、下胚轴为外植体优化北柴胡的离体再生体系,同时构建pCAMBIA1301-BcIAA13植物超表达载体,利用根癌农杆菌对北柴胡进行遗传转化体系初步研究,研究对验证相关功能基因在柴胡生长发育过程中发挥的作用具有重要意义。主要研究结果如下:(1)北柴胡离体组织再生体系优化设置多种诱导配方对北柴胡叶片、茎段、下胚轴进行愈伤组织诱导,试验获得优化再生体系结果为:主要外源激素为2,4-D、TDZ、6-BA等,其中适宜于柴胡叶片、下胚轴、茎段CN的愈伤组织诱导配方是含有2.0mg/L 2,4-D和1.0mg/L TDZ的MS培养基;茎段N的最佳愈伤诱导培养基为MS+1mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+0.5mg/L6-BA+4g/L植物凝胶+30g/L蔗糖。北柴胡下胚轴愈伤组织的不定芽分化率最高,分化率为73.58%,出苗率为54.72%,分化培养基为:MS+0.5mg/L KT;不定芽生根培养中:IBA生长激素不定根诱导效果最好,其中MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶4g/L是柴胡生根的最佳培养基,诱导不定根数10根,根长3.63cm。(2)pCAMBIA1301-BcIAA13植物表达载体的构建以“川北柴1号”幼苗为植物材料提取得到高质量RNA逆转录得到北柴胡cDNA,并通过PCR克隆获取到目的基因BcIAA13,成功构建pCAMBIA1301-BcIAA13植物表达载体。(3)北柴胡BcIAA13基因生物信息学分析对北柴胡BcIAA13基因进行生物信息学分析的结果表明:北柴胡BcIAA13基因序列与胡萝卜生长素调控蛋白IAA13基因序列覆盖度到达71%,相似性高达80%。该基因编码313个氨基酸是结构稳定的酸性蛋白,不存在跨膜区域,具有亲水性,二级结构中含量最高的为β折叠,占全部序列的24.92%,主要存在于植物细胞质间。序列分析结果表明,该基因属于AUX/IAA超级家族,具有AUX/IAA结合结构域I,II,III,IV。进化树聚类分析表明北柴胡BcIAA13基因与胡萝卜亲缘性最近。(4)农杆菌介导的北柴胡遗传转化体系的初步研究利用根癌农杆菌介导法,通过筛选抗生素潮霉素适宜浓度、菌液浓度、共培养时间、外植体种类建立起北柴胡的遗传转化体系。获得转化条件为:侵染菌液OD600≈0.6,侵染时间为10min,共培养2d,潮霉素筛选浓度为25mg/L。其中下胚轴的转化效率最高,抗性愈伤率为46.55%。