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背景与目的： 铜绿假单胞菌属(Pseudomonas aeruginosa, PAE)是医院内重要的革兰阴性无芽孢杆菌条件致病菌，人体免疫力低下时更容易感染PAE菌，是进展性脓毒症最常见病原菌，与脓毒症死亡密切相关。存在于革兰阴性细菌外膜的内毒素（脂多糖）是G-菌导致机体出现全身炎症反应综合征、脓毒性休克、多器官功能衰竭乃至死亡的主要原因。脂多糖与巨噬细胞表面的CD14或TLR4受体结合，引起巨噬细胞的过度活化，释放大量肿瘤坏死因子-α、白介素-6等炎性细胞因子，介导脓毒症的发生。 目前中药复方及化学成分抗内毒素研究多从降低内毒素致实验动物死亡率;抑制促炎细胞因子的过度释放等途径发挥其抗内毒素活性。然而中药单体是否具有直接拮抗内毒素作用的研究仍鲜有报道，本实验旨在观察没食子酸、槲皮素和黄芪甲苷是否抑制铜绿假单胞菌及是否具有直接拮抗内毒素的作用。 方法： 1.培养铜绿假单胞菌 取无菌试管4支加入上述配制的MH(B)培养基4ml，铜绿假单胞菌接种于其中3支试管，未接种铜绿假单胞菌的试管作为阴性对照，置于37℃培养箱内培养18h后，阴性对照试管培养基清亮，无细菌污染，取接种了铜绿假单胞菌的试管，用MH肉汤稀释1∶100备用，其中含菌量约106cfu/ml。 2.实验分组 实验分为6组，分别为空白对照组(Normal)，溶媒对照(250‰)倍比稀释组，阳性对照庆大霉素(100×105U/L)倍比稀释组，没食子酸（156μmol/L）倍比稀释组、槲皮素（254μmol/L）倍比稀释组和黄芪甲苷（318μmol/L）倍比稀释组。 3.检测方法 (1)微量稀释法测定各中药单体对检测菌的最低抑菌浓度(MIC) 在用化学法灭菌后的96孔聚苯乙烯微孔板上标记编号和顺序。根据测定范围将实验药物用MH(B)培养基对倍稀释成一系列浓度:用微量加样器稀释各药物，各组药物终浓度如表1所示，用于以下各项实验。 结果判断:每孔中加入5g/L氯化三苯四氮唑(TTC)5μl，孵育(37℃)1h后，无细菌生长孔无色，无细菌生长孔所含最低抗菌药物浓度即为MIC。 (2)显色基质特异性鲎试剂盒检测中药单体对铜绿假单胞菌内毒素的作用 按试剂盒说明书取无热原微量试管，加入10μl细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液或供试品;再加入10μl鲎试剂溶液，混匀，37℃温育15分钟;温育结束，加入10μl显色基质溶液，混匀，37℃温育5分钟;温育结束，加入50μl偶氮化试剂1溶液，混匀，加入50μl偶氮化试剂2溶液，混匀，加入50μl偶氮化试剂3溶液，混匀，静置6分钟，于545nm波长处读取吸光度值，以内毒素标准溶液和吸光度值建立标准曲线。 4.统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据整理、分析。各组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)较。检测结果以α=0.05作为检验水准。 结果： 1.没食子酸对铜绿假单胞菌的抑制作用及其MIC值 当没食子酸的浓度大于19.5μmol·L-1时，经2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色后，培养基基本为无色，铜绿假单胞菌的生长被抑制，说明没食子酸对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度MIC为19.5μmol·L-1。没食子酸低于MIC浓度组与溶媒乙醇各平行浓度组间对照，进行t检验，P＜0.05，可以认为没食子酸与溶媒乙醇间具有显著性差异，没食子酸单体具有抑菌作用。没食子酸在1.2～19.5μmol·L-1各浓度组间进行单因素方差分析，P＜0.05，具有显著性差异，可以认为其抑菌作用与药物浓度呈正相关。 2.槲皮素对多药耐药铜绿假单胞菌的作用及其MIC值 槲皮素的MIC为63.5μmol·L-1，在低于MIC的浓度范围内各组与溶媒乙醇平行浓度组间对照，进行t检验，P＜0.05，可以认为槲皮素与溶媒乙醇间具有显著性差异，槲皮素单体具有抑菌作用。槲皮素在0.99～63.5μmol·L-1浓度范围内，P＜0.05，具有显著性差异，可以认为槲皮素呈浓度依赖地抑制铜绿假单胞菌的生长。 3.黄芪甲苷对多药耐药铜绿假单胞菌的影响 黄芪甲苷与溶媒乙醇各浓度组平行对照，进行t检验，其结果P＞0.05，表明黄芪甲苷与溶媒乙醇间没有显著性差异，黄芪甲苷单体无抑菌作用。 4.没食子酸、槲皮素和黄芪甲苷对铜绿假单胞菌内毒素的作用 没食子酸（39、78、156μmol·L-1）与铜绿假单胞菌作用后不使鲎试剂显色，在此浓度范围内没食子酸可抑制铜绿假单胞菌生长，并且可以中和铜绿假单胞菌产生的内毒素。在1.2～19.5μmol·L-1浓度范围内，随没食子酸浓度升高，内毒素值降低，各浓度组间进行单因素方差分析，P＜0.05，具有显著性差异，可以认为没食子酸浓度依赖地抑制内毒素产生。 槲皮素、黄芪甲苷、庆大霉素和溶媒乙醇均使鲎试剂显色，不认为具有抑制内毒素作用。 结论： 1.没食子酸和槲皮素对铜绿假单胞菌均有抑制作用。没食子酸尚具抑制铜绿假单胞菌内毒素的作用。 2.黄芪甲苷体外不具有抑制铜绿假单胞菌及其内毒素作用。