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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)俗称猪蓝耳病，是由PRRS病毒(PRRSV)感染所引起的以繁殖障碍、呼吸道疾病以及哺乳仔猪高死亡率等为主要特征的一种急性传染病，对世界养猪业造成极大危害。PRRSV感染引发机体的免疫抑制，形成持续性感染，因此，PRRS临床诊断和研制安全、高效的新型疫苗及小分子抗病毒药物对防治PRRS具有重要意义。本课题首先建立了一种检测PRRSV抗体的ELISA方法;然后对病毒的表位疫苗及蛋白佐剂Gp96在猪体内的免疫应答进行了一系列较为深入的研究;同时还筛选出一种能抑制PRRSV复制的宿主microRNA并探讨其抗病毒的分子机理。具体研究内容和结论如下: 1.PRRSV抗体的ELISA检测方法的建立 将PRRSV经典毒株VR2332的N蛋白和高致病性PRRSV（HP-PRRSV）毒株JXA(1)的Gp5蛋白的C端(128～200aa)通过连接肽序列连接起来并在大肠杆菌中表达，经过纯化后获得高纯度的活性重组融合蛋白N-Gp5c(rN5c)。以此蛋白为包被抗原，建立了检测PRRSV抗体的ELISA方法，确定了判定标准S/P的临界值为0.19。本方法特异性高;与IDEXX的PRRS检测试剂盒的符合率在95％以上;成本低廉且重复性好。这一研究为监测PRRS的流行状况提供了良好的检测手段。 2.PRRSV串联B表位亚单位疫苗的研究 通过接头分子将一些PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白Nsp2的高度保守B细胞抗原表位连接起来，利用重叠PCR技术获得其融合基因并将其重组进原核表达质粒中，经过大量表达和纯化后得到串连B表位亚单位疫苗(Cp1/2);同时表达纯化猪源Gp96的N端(22-370aa)作为免疫佐剂，与Cp1/2联合免疫实验小鼠和猪。经过3次免疫后，在小鼠和猪模型上，通过ELISA能检测到PRRSV特异性抗体(IgGs)，而Gp96则能提高其抗体滴度3-4倍;ELISPOT及淋巴细胞增殖实验表明Gp96能显著提高疫苗诱发的细胞免疫;另外，病毒-血清中和实验发现，从免疫该疫苗的小鼠血清中能检测到中和抗体(NA)，而不能在猪血清中检测到NA。此外，Gp96能显著上调猪血清中IFN-γ，IL-12等Th1型细胞因子以及TNF-α，并下调IL-4和IL-10的水平。以上研究为将Gp96作为佐剂联合表位疫苗应用予PRRS的防治提供了理论依据。 3.PRRSV合成肽疫苗的研究 利用已发表的一些PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白的高度保守B细胞和T细胞抗原表位，直接化学合成这些表位多肽;同时表达纯化猪源Gp96作为一种免疫佐剂，与合成表位肽疫苗联合免疫实验动物（小鼠和猪）。结果发现，这些B表位肽和T表位肽能激活机体产生PRRSV特异性体液免疫和细胞免疫应答，Gp96能增强这种效应。此外，利用定量ELISA方法检测猪血清中一些细胞因子含量发现Gp96能显著上调IL-12和TNF-α，下调IL-4和IL-10的水平。在免疫多肽疫苗后的猪体内感染HP-PRRS病毒JXwn06毒株，发现对照组（免疫PBS组及免疫Gp96组）的猪在攻毒第三天全部死亡，多肽疫苗免疫组的猪在第五天全部死亡，而多肽疫苗+Gp96佐剂组的猪在第七天才全部死亡;通过测定攻毒后猪的体温、观察临床发病症状、血清中病毒载量以及肺部病变情况检测等发现，在PRRSV感染早期（七天内），多肽与Gp96联合作为疫苗能在一定程度上缓解猪的发病症状，降低猪血清中活病毒载量，减轻肺部组织病变。以上研究为PRRS合成肽的研发及Gp96作为免疫佐剂的应用提供了理论依据。 4.抑制PRRSV复制的宿主microRNA的筛选及其作用机理研究 宿主microRNA(miRNA)作为一种转录后的基因调控分子，在病毒感染以及天然免疫系统中发挥着重要作用。本研究筛选到miR-26a能显著抑制PRRSV的复制，这种抑制效应呈现出明显的剂量依赖性和时间延续性，而且在PRRSV感染建立之后同样能起到有效治疗并清除PRRSV的效果;进一步的荧光素酶报告基因实验发现miR-26a并非作用于病毒基因组;深度测序（RNA-Seq）结果发现miR-26a能明显增强宿主的干扰素(IFN)信号通路中RIG-(I)、MDA5和TLR3基因的表达，同时还能激活大量的IFN诱导基因其他抗病毒基因的表达。这为研究miR-26a如何调控宿主的抗病毒机制提供新线索，为进一步将miR-26a作为PRRSV的抗病毒制剂的研发及抗病毒猪的育种提供理论依据。