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尿酸结石是泌尿系结石中一种常见的类型，其发病率在许多国家和地区出现逐年上升趋势。尿酸结石形成的影响因素众多但机制尚不明确，目前研究认为高尿酸尿对尿酸结石的形成起着至关重要的作用。尿液中的尿酸水平主要取决于肾小球的滤过与肾小管对它的分泌和重吸收之间的平衡，而肾小管对尿酸的分泌程度直接决定了尿尿酸水平的高低。 近年研究发现，遗传因素是影响结石形成的众多因素之一，多个基因已初步被证实与结石的发生存在密切关系。全基因组关联研究（GWAS）表明ABC转运蛋白超家族 G亚家族第2成员（ABCG2）基因存在多个单核苷酸多态性（SNP）位点与高尿酸血症、痛风的发病相关联。而 rs2231142（Q141K）是ABCG2第5个外显子上的错义突变位点，该位点突变与高尿酸血症及痛风的发生密切相关，尤其在男性表现更为明显，但是该位点突变与尿酸结石形成的关系尚未见报道。 进一步的动物实验表明 ABCG2基因敲除导致小鼠呈现出肾脏尿酸排泄量明显增加，肠道排泄尿酸量减少，而体内血尿酸水平增加，这提示 ABCG2蛋白在肾外及肾性尿酸排泄过程中都发挥了重要生理作用。在我们前期实验中，通过沉默HK-2细胞ABCG2基因，我们发现该细胞排泄尿酸能力明显受损，且其他尿酸转运体并不能代偿。由此我们推测 ABCG2基因表达的下调可能是导致肾脏细胞尿酸转运能力的下降和尿酸分泌减少，继而诱发高尿酸尿症和尿酸结石形成的重要原因之一，但仍需要进一步的实验验证。 已有研究证实ABCG2基因的遗传变异可导致ABCG2蛋白的表达下降，进而影响其尿酸转运功能。因此，了解 ABCG2基因遗传变异在尿酸结石人群中的分布情况，明确与尿酸排泄相关的SNPrs2231142位点突变在细胞水平及大鼠体内对尿酸代谢和尿酸结石形成的影响，从而探明 ABCG2基因遗传变异在尿酸结石形成过程中的作用及其可能机制，为临床筛查尿酸结石易感人群和尿酸结石的防治提供新的实验依据。 目的： 1.比较尿酸结石病人及正常非结石体检人群尿酸代谢相关基因的单核苷酸多态性位点的分布，进一步探索ABCG2基因SNP rs2231142位点突变与尿酸结石形成的关系； 2.分别构建 ABCG2基因沉默 NRK稳定细胞株、ABCG2稳定过表达及Q141K位点突变的HEK-293细胞株，并检测ABCG2基因沉默、过表达及Q141K位点突变在细胞水平上对尿酸转运功能影响； 3.采用CRISPR/Cas9技术构建ABCG2基因敲除SD大鼠动物模型，为下一步验证ABCG2蛋白在体内对尿酸转运影响的机制研究奠定基础。 方法： 1.以该院泌尿外科接受手术的尿酸结石患者及体检中心无结石正常体检人群为对象分别设立尿酸结石组及正常对照组，比较两组人群一般资料，提取血液基因组DNA，并用质谱法检测尿酸转运相关基因的单核苷酸多态性（SNP）位点基因型，通过回归分析研究两组人群中存在统计学差异的SNP基因型分布以及相对应的等位基因A、T与尿酸结石的发生的相关性。 2.设计合成四对Rat-ABCG2基因沉默序列（shRNA），构建ABCG2-shRNA重组表达载体瞬转NRK细胞，并采用RT-PCR及Western blot检测ABCG2表达变化，筛选出最高沉默效率的shRNA序列。将沉默效率最高的ABCG2-shRNA片段插入慢病毒表达载体pLKO.3G质粒，构建ABCG2沉默序列重组慢病毒质粒pLKO.3G-shRNA。 3.提取SD大鼠组织RNA， PCR扩增ABCG2基因CDS序列片段，并利用点突变的方法构建ABCG2基因Q141K位点突变CDS序列；分别将ABCG2基因CDS序列及突变CDS序列通过双酶切法插入慢病毒表达载体pLEX-MCS质粒，构建 ABCG2过表达及点突变重组慢病毒质粒 pLEX-ABCG2和pLEX-mutABCG2。 4.利用慢病毒包装系统分别包装 ABCG2基因沉默、过表达及位点突变慢病毒液，将携带 pLKO.3G-shRNA的慢病毒颗粒感染 NRK细胞；携带pLEX-ABCG2及pLEX-mutABCG2的慢病毒液分别感染HEK-293细胞，嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株；通过高效液相色谱-质谱联用法检测各组细胞外排尿酸盐浓度，评估ABCG2基因沉默、过表达及Q141K位点突变对尿酸盐转运功能的影响。 5.利用CRISPR/Cas9基因靶向技术，构建针对目的基因ABCG2的gRNA，体外转录为mRNA，显微注射法将gRNA/Cas9 mRNA混合物注入SD大鼠的受精卵中，并行胚胎移植至假孕雌鼠；对构建的新生大鼠行基因测序鉴定，并传代至产生ABCG2基因敲除的SD大鼠。 结果： 1.本研究共纳入尿酸结石患者166例，正常对照164例，两组人群在性别、年龄方面无统计学差异，但尿酸结石组患者血尿酸浓度明显高于正常对照组。尿酸结石组SNP rs2231142发生位点突变的频率高于正常对照组人群；尿酸结石组与正常对照组相比，A等位基因频率有显著性差异；相比CC基因型，CA基因型和AA基因型使尿酸结石发生的OR分别是2.58（95％CI:1.59~4.18, p<0.001）和4.76（95%CI:2.27~9.97, p<0.001）；A等位基因与尿酸结石发生显著相关OR=2.93，（95%CI:1.85~4.66，p<0.001）。 2.半定量RT-PCR及Western blot分析发现pGP-sh1856瞬转NRK细胞后， ABCG2基因mRNA及蛋白表达均明显下降，提示ABCG2干扰序列sh1856有明显的沉默效率。将该干扰序列通过双酶切法与慢病毒表达载体pLKO.3G质粒连接后，PCR扩增产物电泳及测序证实连接正确。 3.成功钓取 Rat-ABCG2目的基因 CDS序列，并构建 Rat-ABCG2基因CDS序列Q141K位点突变；通过双酶切方法将Rat-ABCG2目的基因顺利插入慢病毒表达载体pLEX-MCS质粒，并成功将GFP基因片段连入重组表达质粒。酶切后 PCR扩增产物电泳及测序鉴定证实 pLEX-ABCG2、pLEX-mutABCG2重组慢病毒表达载体构建成功。 4.成功构建ABCG基因沉默的NRK细胞，荧光显微镜下表达GFP蛋白的NRK细胞>90%；RT-PCR及Western blot结果显示pLKO.3G-sh1856转染组NRK细胞内ABCG2 mRNA和蛋白表达水平较对照组NRK细胞明显下降。液相色谱-质谱对细胞培养液尿酸盐浓度检测发现 pLKO.3G-sh1856转染组 NRK细胞外排尿酸盐浓度较对照组NRK细胞降低。 5.构建成功的 ABCG2过表达及点突变 HEK-293细胞于荧光显微镜下观察，表达GFP蛋白的HEK293细胞>90%；RT-PCR及Western blot结果显示pLEX-ABCG2、pLEX-mutABCG2转染组HEK293细胞内ABCG2 mRNA和蛋白表达水平增高。液相色谱-质谱检测显示pLEX-ABCG2、pLEX-mutABCG2转染组HEK293细胞外排尿酸盐浓度较对照组HEK293细胞明显升高，且 pLEX-mutABCG2转染组 HEK293细胞外排尿酸盐浓度约为 pLEX-ABCG2转染组50%，两组间差异显著。 6.针对ABCG2第二个外显子成功设计并合成两对gRNA及扩增片段引物，经显微注射gRNA/Cas9 mRNA至受精卵雄性原核并胚胎移植孕育后，产生15只首建鼠，经提取大鼠组织基因组 DNA，利用特异性引物 PCR扩增后电泳及测序鉴定、筛选得到目的基因特定序列敲除的SD大鼠杂合子，合笼传代至F2代时获得目的基因ABCG2敲除的SD大鼠动物模型。 结论： 1.人群中ABCG2 rs2231142单核苷酸多态性与尿酸结石形成相关，且CA基因型、AA基因型及A等位基因与尿酸结石发生呈正相关。 2.成功筛选出具有显著ABCG2沉默效果的shRNA序列，构建了ABCG2基因沉默的NRK稳定细胞株，说明pLKO.3G-ABCG2-shRNA可以下调NRK细胞内ABCG2基因mRNA及蛋白的表达水平。 3.成功构建Rat-ABCG2及其Q141K位点突变的重组慢病毒表达载体，并顺利构建稳定表达Rat-ABCG2的HEK293细胞株，说明pLEX-ABCG2慢病毒载体能上调HEK293细胞内ABCG2基因mRNA及其蛋白的表达水平。 4. ABCG2基因沉默的NRK细胞尿酸盐外排浓度下降，提示ABCG2基因沉默导致了其编码蛋白的尿酸盐转运功能障碍。 5. ABCG2过表达能显著提高HEK293细胞外排尿酸盐浓度，而ABCG2 Q141K位点错义突变可降低HEK293细胞尿酸盐分泌浓度，提示ABCG2基因编码蛋白对细胞尿酸盐的分泌起重要转运体作用，而Q141K位点突变可能导致其编码蛋白结构改变和功能下调。 6.采用CRISPR/Cas9基因靶向技术可成功构建ABCG2基因敲除SD大鼠模型，为下一步研究奠定了基础。