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目的:研究国内分离的致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)132与国外模型菌株UPECJ96及完成基因组测序的非致病性大肠杆菌K-12 MG1655的蛋白质组的差异。方法:1.对UPEC 132、UPEC J96和E.coli K-12 MG1655进行革兰染色、生化反应、papC PCR检测,鉴定菌株。2.采用比浊法进行细菌计数并绘制各菌株的生长曲线。以此为依据,分别培养至对数生长前期(6h)和后期(12h),离心收获菌体,超声破菌制备双向凝胶电泳蛋白样品,Bradford法测蛋白浓度。3.优化细菌培养和双向凝胶电泳的试验条件:(1)将UPEC132不同培养时间收获的菌体或不同pH梯度下进行的双向凝胶电泳图谱进行比较分析;(2)根据E.coli K-12 MG1655的基因组注释结果,使用pI/Mr Prediction Tool(http:∥www.expasy.org/tools/pi_tool.html)计算,构建其理论双向凝胶电泳图谱,预测其全部蛋白点的分布情况;(3)用pH 4-7的IPG胶条对E.coli K-12MG1655的胞内蛋白样品进行双向凝胶电泳,与其理论双向电泳图谱进行比较,计算分辨率。4.依据优化的条件,分别对三株菌的蛋白样品进行双向凝胶电泳,电泳后经考马斯亮蓝染色,采集图像,使用PD Quest7.0软件对图像进行配比分析。以UPEC 132为核心,选取其特异的及上调表达(表达量差异2倍以上)的蛋白点进行凝胶内胰蛋白酶消化萃取和MALDI-TOF-MS质谱分析。结果:1.UPEC132、UPEC J96以及E.coli K.12 MG1655菌株的鉴定1)三株菌均为革兰阴性杆菌,生化反应符合大肠杆菌。2)papC PCR结果显示:UPEC132和J96均出现预期328bp的阳性扩增带,而E.coli K-12 MG1655没有显示此扩增带,可确定前二者为UPEC菌株。2.三株菌生长曲线相似,经过短暂的迟缓期后进入对数生长期(2-12h)。3.三株菌培养6h收获菌体制备胞内蛋白电泳样品,其蛋白浓度分别为:10.63mg/ml、11.93mg/ml以及11.55mg/ml,培养12h制备的胞内蛋白样品其蛋白浓度分别为11.06mg/ml、12.84mg/ml及12.52mg/ml,结果符合要求。4.双向凝胶电泳试验条件的优化分析1)UPEC132培养6h和12h双向凝胶电泳图谱分布相似,经PD Quest软件分析,前者分辨出472个蛋白点,后者为513个蛋白点,后者蛋白点较前者增加了8.69%。2)UPEC132经pH 3-10的IPG胶条分离获得的双向电泳图谱中蛋白点集中于pH 4-7区间,碱性区域蛋白点稀疏;而用pH 4-7的IPG胶条分离的双向电泳图谱中蛋白点分布均匀,分辨率较好。经软件分析表明,二者蛋白点数分别为268和513,后者分离效果明显优于前者。3)E.coli K-12 MG1655全菌蛋白的理论双向凝胶电泳图谱显示:62.9%的理论蛋白点都集中于pH 4-7之间,27.1%的理论蛋白点分命于pH 8-10之间,只有5.3%的理论蛋白点位于pH 7-8之间。4)使用pH 4-7的IPG胶条分离获得E.coli K-12 MG1655胞内蛋白的双向凝胶电泳图谱,与上述理论图谱相比较已有13.2%(356个)的蛋白点显现。据报道,在当前试验条件下双向凝胶电泳分辨率尚不超过理论值的10%,故本试验的分辨率较为理想。5.双向凝胶电泳结果显示:UPEC132平均识别466±11个蛋白点,J96平均识别382±12个蛋白点,E.coli K-12 MG1655平均识别338±15个蛋白点。三株菌共有的蛋白点为298个(59.7%),UPEC132和E.coli K-12 MG1655共有的蛋白点为33个(6.6%),UPEC132和J96共有的蛋白点为56个(11.2%);UPEC132特异的蛋白点为89个(17.8%),J96特异的蛋白点为22个(4.4%),MG1655特异的蛋白点只有1个(0.2%)。6.经MALDI-TOF-MS分析,22个差异蛋白点得到鉴定,其中15个为UPEC132特异或明显上调表达的蛋白点,7个为UPEC132与J96均上调表达的蛋白点,涉及毒力因子、物质代谢转运、蛋白合成调节、生物氧化及未知功能等。结论:本研究获得了UPEC132、UPEC J96以及E.coli K-12 MG1655胞内蛋白的双向凝胶电泳图谱,通过对三者之间蛋白表达的差异分析,发现了UPEC菌株与非致病性大肠杆菌间的蛋白质组有差异,UPEC132与J96蛋白质组间也有显著不同,表明UPEC菌株存在多态性和国内外菌株的差异,为致肾盂肾炎大肠杆菌的致病机制等深入研究奠定了基础。