顶头孢霉qde2与产黄青霉转运蛋白基因penT的功能研究

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顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)是β-内酰胺类抗生素头孢菌素C(CPC)和青霉素的产生菌,本文对顶头孢霉(GCMCC3.3795)Argonaute蛋白编码基因qde2和产黄青霉(GCMCC3.5129)转运蛋白编码基因penT进行了功能研究。  Argonaute(Ago)蛋白是真核生物RNAi途径中的效应蛋白,能结合生物体内非编码smallRNA,参与到序列特异的基因沉默过程。本文通过基因敲除、过表达及遗传回补等开展了对顶头孢霉基因组上两个qde2基因(qde2-A和qde2-B)的功能研究。实验结果表明,qde2-A基因敲除突变株生长速率加快,对过氧化氢耐受性增强的同时突变株中抗氧化相关基因转录水平也相应升高;qde2-A过表达菌株则在固体培养基上生长变缓,对外界氧化刺激敏感性增强,液体发酵结果显示CPC产生水平提高;而过表达qde2-B不能提高CPC产量。暗示qde2-A和qde2-B在顶头孢霉中具有不同的作用。  通过RNA-seq对顶头孢霉smallRNA进行了测序和分析,并对其中两个miRNA-like基因(milR-14和milR-19)进行了初步研究。milR-14和milR-19基因在顶头孢霉野生型和qde2-A基因敲除突变株中均有表达,并形成成熟的milR-14和milR-19。序列分析表明其调控的靶基因可能是TOR激酶编码基因Actor,后者是真核生物保守存在的丝氨酸/苏氨酸激酶,与菌体生长和感应外界营养条件变化相关。在milR-14和milR-19过表达菌株中,Actor基因转录水平下降,并间接影响了CPC的产生。为进一步研究顶头孢霉中small RNA的作用机制,对Dicer酶基因(dcl-1和dcl-2)以及核酸外切酶基因qip分别进行了基因敲除。初步的实验结果表明,顶头孢霉DCL2不参与milRNA的生成过程,行使功能时不依赖于QDE2-A。  产黄青霉转运蛋白基因penT的转录受到青霉素发酵前体物质苯(氧)乙酸(PAA/POA)诱导,通过构建过表达、基因倍增以及knockdown菌株来研究penT基因在青霉素产生过程中发挥的作用。结果表明penT基因knockdown菌株青霉素产量降低,过表达促进青霉素产生;基因倍增菌株中青霉素G的产量提高了1倍,同时对发酵前体PAA敏感性增强。综上结果推测penT基因编码的膜转运蛋白可能参与到将培养基中的前体物质PAA/POA转运到细胞内供青霉素侧链合成的过程。
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