与OsLSR互作的水稻OsSO基因的功能研究

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OsLSR是本实验室根据插入位点信息从转Bt基因抗虫水稻T51-1中克隆的一个结实率相关基因。转基因位点旁侧序列测序分析表明,外源Bt基因是插入在OsLSR基因编码区ATG上游797bp处,并导致了OsLSR基因的上调表达和转基因系T51-1结实率的下降,这也是该基因名称OsLSR(Oryza sativa Low Seed-setting Related gene)由来的原因。随后通过反向遗传学对OsLSR基因进行了功能剖析,发现该基因不仅参与免疫应答的信号传递,而且调控花发育过程及影响结实率。  在实验室以上研究的基础上,本研究通过酵母双杂交筛选出与OsLSR互作的蛋白亚硫酸盐氧化酶(OsSO),并克隆了该基因,初步研究了其功能,主要结果如下:  1.分离克隆水稻的OsSO基因,生物信息学分析表明,该基因位于水稻第8号染色体上,全长1548bp,其中,CDS位于50bp-1243bp,长1194bp,编码398个氨基酸。  2.酵母双杂交实验表明,OsSO完整蛋白与OsLSR完整蛋白存在互作,之后,通过对两个蛋白进行分结构域互作研究发现,OsSO的钼辅因子结构域与OsLSR的CC(Coil-coiled)结构域为两者主要的互作区域。原核表达结果表明,OsSO和OsLSR的CC蛋白在30℃条件下经浓度为1mg/mL的IPTG诱导能实现融合蛋白的高效表达;WesternBbt印迹检测也证实大肠杆菌DE3中表达了分子量分别为43kD和19.8kD的蛋白质,与预测分子量大小基本一致。  3.在烟草(Nicotiana benthamiana)中瞬时表达融合eGFP荧光蛋白的融合蛋白OsSO∷eGFP,发现该融合蛋白主要位于细胞核,在细胞质膜中仅有少量分布。然而当38h后再观察时,无论是在细胞核还是在细胞质膜中都观察不到绿色荧光信号的分布。  4.通过调控OsSO基因表达水平,即由35s启动子驱动的过表达和RNAi干扰的基因沉默,来研究OsSO表达水平与植物免疫系统的关系。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明OsSO的表达上调或下调均能诱导PR基因表达,说明OsSO基因对水稻的免疫应答起调控作用。  5.用亚硫酸钠(Sodium sulfite)盐处理OsSO过表达和RNA干扰叶片,之后,再进行二氨基联苯胺(DAB)染色实验,发现前者的染色比后者浅,表明后者即RNA干扰叶片中的活性氧自由基含量高,使细胞处于胁迫状态。该结果因此说明OsSO会消除植物体内过多的亚硫酸盐而起到解毒作用,以防止植物受到伤害。  
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