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光温敏核不育系水稻PA64S的育性转换与日照长短和温度高低有密切关系,一般表现为长日、高温条件下不育,短日、低温条件下可育。光敏不育基因pms3等的鉴定揭示了PA64S等光温敏不育系水稻受光周期的影响调控花粉育性的分子机制,但是温度如何参与PA64S育性调控的内在机制尚不明确。本研究拟探讨PA64S孕穗期高、低温条件下miRNA的表达谱差异,筛选PA64S与温敏育性关联的miRNAs及其靶基因,为进一步解析PA64S温敏育性调控的分子机制奠定基础。对PA64S水稻单核期早期花药分别经过30℃(雄性不育)和22℃(雄性可育)处理,构建两个cDNA文库(PA64S-H、PA64S-L),并进行miRNA高通量测序,对PA64S不同温度下的mi RNA表达谱进行了初步的研究,主要结果如下:1、本研究经不育高温(30℃)和可育低温(22℃)处理两周的孕穗期PA64S水稻花药为材料,Trizol法提取其RNA,琼脂糖凝胶电泳检测提取的样品28S RNA和18SrRNA条带清晰,说明样品RNA降解较少,OD260/OD280比值在1.8-2.2之间说明RNA纯度较高,可用于下一步实验。提取的合格RNA样品分别反转构建了两个cDNA文库PA64S-H和PA64S-L。2、通过对这两个cDNA文库进行高通量测序并分析发现,PA64S-H文库有14030132条原始序列,排除低质量序列和污染物等背景干扰有6788401条可读有效序列(54.14%),其中有4289438条序列(63.18%)可以比对到mi RNA数据库。PA64S-L有16844884条原始序列,排除背景干扰后有12484929条可读有效序列(89.71%),其中有7743506条序列(62%)可以比对到miRNA数据库。两个文库的小RNA长度分析显示24nt(miRNA标准长度)丰度最高,说明上述分析有效,这些初步处理过的原始数据将进行后续分析。3、由miRBase、GeneBank数据库分析和PatMatch软件预测排除重复序列后可知两个cDNA文库一共有584条mi RNA,其中已知miRNA(45%)263条和候选新miRNA 321条(55%)。两个文库miRNA首位核苷酸偏倚分析发现已知miRNA与新的候选miRNA一样,都是U(尿嘧啶)居多,且都形成miRNA典型的茎环结构,说明这两种mi RNA结构一致。根据测序文库的miRNA表达量信息在已鉴定的263条已知miRNA中,有151条是两个文库都有表达的,有56条分别只在PA64S-H和PA64S-L特异性表达;在321条新的候选miRNA中,有63条两个文库都有表达,144条只在PA64S-H表达,114条只在PA64S-L表达,已知miRNA与新的候选miRNA在两个文库中都有明显特异性表达。通过上述分析和相关表达量分析,本研究发现133条已知miRNA在PA64S-H和PA64-L中表达量差异显著。这些显著差异的已知miRNA可能与PA64S不育系水稻育性有关。4、为了进一步验证从高通量测序中获得的差异表达miRNA数据是否可信,我们随机抽取6个差异表达的已知miRNA反转后通过荧光实时定量PCR分析检测其表达水平。结果发现,与PA64S-L相比,PA64S-H中miR531、mi R6300和miR9773的表达水平降低,而miR1118、miR2275和miR9473的表达水平上调。qRT-PCR的结果与高通量测序结果表达量分析一致,说明高通量测序结果可靠。5、我们在对这些差异表达的miRNA作用的靶基因及其功能预测时重点关注已有报道的可能与水稻不同温度下育性相关的miRNA及靶基因。miRBase、GeneBank数据库预测出5944个差异表达miRNA对应的靶基因。去除重复靶基因后已知miRNA对应2226个,新的候选mi RNA对应233个。因为新的候选mi RNA能预测的靶基因数量明显低于已知miRNA,且新的候选miRNA结构与已知miRNA相似,对应的靶基因也应与已知miRNA靶基因相同。所以重点分析已知mi RNA。这些显著差异的已知mi RNA预测的靶基因包括MYB、TCP转录因子、生长素应答因子基因(ARFs)等。这些基因已有报道与水稻外界温度信号响应和花药花粉发育有关。这说明本研究文库间显著表达差异的mi RNA及其靶基因可能与水稻育性相关。6、为了进一步阐明显著差异表达mi RNA靶基因的功能,本研究对其进行了GO term(gene ontology)分析和KEGG代谢途径分析。GO分析发现这些显著差异表达的miRNA的靶基因作用的生物过程主要集中在代谢过程、胞内过程和外界刺激,作用细胞组分主要在细胞、细胞部分区域、细胞器,分子功能主要是结合,催化及转运。这与已报道的水稻花粉花药发育相关基因分子功能与作用细胞组分一致。KEGG分析发现靶基因参与的代谢途径包括了淀粉和蔗糖代谢途径、鞘磷脂代谢途径、精氨酸和脯氨酸代谢途径,这三种代谢途径已有报道与水稻花药花粉发育相关。此外,靶基因参与的植物激素信号转导途径也表明miRNA可能通过调控植物激素信号途径来影响水稻花粉花药发育。7、根据光温敏不育系水稻不育的生理生化特性对差异表达miRNA靶基因代谢途径进行聚类分析,可分为植物激素与信号转导相关途径、能量及物质代谢相关途径、蛋白质合成运输及降解途径、DNA RNA合成运输相关途径。大部分显著差异表达的miRNA靶基因代谢途径都在这四类中,表明mi RNA与光温敏不育系水稻不育密切相关。综上所述,我们通过高通量测序技术对光温敏不育系水稻PA64S花药在不育温度和可育温度下的miRNA表达谱进行分析,发现miRNA参与了不同温度下不育系水稻PA64S的育性调控。