荔枝果实发育过程中Lc-hmg基因定量表达特征与功能初步分析

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对番茄、油梨和甜瓜的研究结果显示HMGR参与了果实的生长和发育,并为果实的细胞分裂和生长提供充足的类异戊二烯化合物。在不同种类植物上hmg基因的同源基因在表达模式和功能上表现出不同程度的差异性,但在荔枝中该基因的表达和功能分析未见报道。因此,本论文应用流式细胞术、实时荧光定量PCR和转基因技术等技术,检测了荔枝果实不同发育时期的细胞分裂活性并对荔枝Lc-hmg的表达与功能进行了初步研究,旨在进一步巩固荔枝果实大小属于细胞数量决定型的观点,并揭示Lc-hmg在荔枝果实发育过程中的变化规律及对果实大小的调控机制。主要的研究结果如下:   1建立了一套适合于流式细胞术的荔枝细胞核悬液的提取方法。主要探讨了5种细胞核分离缓冲液对制各样品DNA分辨率效果的影响,并对其成分和制备方法进行适当的改进以获得最佳的提取效果.结果表明:优化后的Otto buffers表现的分辨率最高,细胞G1/G0峰产生的变异系数最低(Cv=7.58%),而且组分简单、成本低,且能在正常室温条件下分析和保存,适合于荔枝细胞核悬液的制备。   2‘妃子笑’早花大果子房壁和果皮中细胞分裂活性在整个发育早期均高于晚花小果,并且在开花前7d子房壁发育阶段S+G2/M所占的比例最高,处于分裂最旺盛时期。这说明具有相同遗传背景的相同品种不同花期果实大小的差异与其细胞分裂活性差异相关联。   3研究结果表明,‘妃子笑’早花果实的平均鲜重(34.58g)远大于晚花果(20.58g).采用实时荧光定量PCR技术对‘妃子笑’早花果和晚花果果实发育期间Lc-hmg1和Lc-hmg2基因的表达差异进行了分析.结果表明这两个基因在果实发育期间具有不同的表达模式。在果皮、假种皮和种子中,Lc-hmg1随着果实的发育其表达均呈现逐渐下降的趋势。早花果各组织(子房壁、果皮、假种皮和种子)中Lc-hmg1无论在基因表达强度还是高丰度表达的持续时间上均大于晚花果,这表明了Lc-hmg1在调控不同花期果实大小上具有重要的作用。   Lc-hmg2具有与Lc-hmgl的不同的表达特征,在不同花期的果实中显示出相似的表达趋势。果皮中,在花后7d时Lc-hmg2徒然升至表达的高峰,随后表达丰度迅速下降,直到花后60 d(早花果)和花后46 d(晚花果)才有小幅回升并一直维持到成熟期。果肉中,随着假种皮的发育Lc-hmg2的表达逐渐增强,并在成熟期达到高峰。而在种子中,随着种胚的快速发育(早花果为花后53 d-60 d:晚花果为花后46 d-53 d)Lc-hmg2的表达被诱导而迅速增强,而在高峰过后随即迅速降低直到成熟。这些结果表明了Lc-hmg2可能与荔枝果实成熟以及假种皮和胚的快速发育相关。   4成功构建了pCAMBIA-Lc-hmg1植物表达载体,并通过对番茄的遗传转化培养获得了转Lc-hmg1番茄植株。通过对获得的转Lc-hmg1番茄植株进行初步的PCR检测,结果表明Lc-hmg1已整合到番茄植株的基因组中。
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