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背景与目的下咽癌(Hypopharyngeal carcinoma)是头颈恶性肿瘤中预后最差的一种,其具有的恶性肿瘤的生物学行为及特征:侵犯性、扩散性及转移性均很高,早期即容易出现粘膜下播散和淋巴转移。目前国内外较为确切的有效的治疗方法是以根治性手术为主,辅以局部放射和全身应用化学药物的综合疗法。综合治疗下咽癌的方法及技术在不断改进,但下咽癌患者总体的5年生存率并没有得到明显改善.近年来,药物在头颈肿瘤肿瘤的治疗中的作用逐渐受到重视,目前认为对于晚期以及复发、或转移的下咽癌患者化疗和或靶向药物治疗是主要手段。化学药物能降低头颈鳞癌远处转移率,减少肿瘤的复发、转移、提高患者生存率。研究下咽鳞状细胞癌在化学药物作用下的分子机制,希望产生新的治疗下咽癌的有效方法。在化学药物的作用下肿瘤会出现死亡,一方面是药物对肿瘤细胞的细胞毒作用,使肿瘤细胞的被动死亡即坏死,另一方面更在于其诱导肿瘤细胞凋亡.恶性肿瘤的基本特征之一是:凋亡受阻,并对凋亡诱导因子的敏感性降低,使机体不能清除肿瘤细胞。近年来,越来越多的研究表明:化疗药物对细胞产生诱导凋亡是其主要作用机制。化疗药物可以诱导肿瘤细胞发生凋亡而达到抑制肿瘤的作用。目前发现内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)能够介导细胞凋亡,这是一种新的细胞凋亡途径,关于内质网应激在细胞凋亡中的重要作用,越来越得到广泛的重视。内质网是真核细胞中最普遍和重要细胞器,是蛋白质与脂质、糖类的合成场所,蛋白质在内质网中合成、折叠、组装、运输。当细胞内源或外源的因素会导致内质网生理功能发生紊乱,未折叠蛋白和错误蛋白积累过量,激活一系列信号通路,引起内质网应激(ERS)。内质网应激时细胞存活和凋亡程序同时激活,如果内质网应激持续进行就会启动细胞凋亡程序。内质网应激决定了细胞的生存还是死亡。在肿瘤细胞中,内质网应激一方面直接诱导细胞死亡另一方面也使肿瘤细胞产生耐药性。阿霉素(Doxorubicin)是一种广泛应用于临床的有效抗肿瘤药物。它通过插入DNA碱基对使DNA降解,影响DNA转录而实现肿瘤的治疗作用。阿霉素是对肿瘤细胞的周期性非特异性药物,对各种生长阶段肿瘤细胞的都有杀死作用。其抗肿瘤谱超过任何其他类型的化疗药物。但阿霉素因其本身的细胞毒性的副作用,同时也限制了它的临床应用。其抗肿瘤谱超过任何其他类型的化疗药物。但阿霉素因其本身的细胞毒性的副作用,同时也限制了它的临床应用。大量文献报道阿霉素可诱导多种肿瘤细胞凋亡,但对人下咽鳞状细胞癌的凋亡作用还未见报道,其诱导凋亡的详细作用机制尚未明了。阿霉素是否可以通过介导内质网应激引发FaDu的细胞凋亡?因此我们建立阿霉素诱导下咽癌细胞系细胞(FaDu)凋亡的实验体系模型,在这个实验平台中研究下咽癌细胞系(FaDu)在内质网应激凋亡过程中的分子机制,探讨内质网应激在药物作用下对肿瘤细胞凋亡的影响,希望从肿瘤发生凋亡的分子生物学的基础上寻找内质网应激介导细胞死亡的药物作用靶点,以期将来在化疗药物研制上,能设计和开发针对ERS信号通路的有效药物来遏制下咽癌,这是本实验所具有的积极意义。材料与方法以人下咽鳞状细胞癌细胞系(FaDu)为实验材料,1.FaDu细胞培养。然后用SRB比色法,在阿霉素浓度和处理时间不同的情况下,检测FaDu细胞的存活率。2.应用梯度为OμM,0.5μM,1μM,2μM的阿霉素作用于FaDu细胞,Western blot检测FaDu细胞凋亡和内质网应激相关蛋白的表达水平变化。3.在有效药物浓度1μM阿霉素作用不同时间后,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白和内质网应激相关蛋白的表达水平变化。4.0.5μM的阿霉素(DOX)和0.5μM的毒胡萝卜素(TG)联合用药,SRB法检测细胞存活率;Western blot检测FaDu细胞凋亡和内质网应激相关蛋白的表达水平变化。5.0.5^μM的阿霉素(DOX)和1mM 4-PBA(4-苯基丁酸)联合用药,SRB法检测细胞存活率;Western blot检测FaDu细胞凋亡和内质网应激相关蛋白的表达水平变化。结果:1.结果显示,阿霉素(Doxorubicin)可以显著降低FaDu细胞相对存活率,其效应具有显著的时间和剂量依赖性。2.应用doxorubicin的时间梯度和浓度梯度,随着浓度增加和处理时间的增加,Western blot检测结果显示凋亡相关蛋白CASP8,CASP3,PARP-1切割增强,TNFRSF10B表达水平上升,CFLARL表达下降;内质网应激相关蛋白EIF2AK3,ATF4,DDIT3表达水平下降,ERN1,XBP1s表达水平上升。3.敲低EIF2AK3,Western blot检测结果显示凋亡相关蛋白CASP8,CASP3,PARP-1切割增强,TNFRSF10B表达水平上升,CFLARL表达下降。4.Doxorubicin联合TG,Western blot检测结果显示凋亡相关蛋白CASP8,CASP3,PARP-1切割减弱,内质网应激相关蛋白ERN1,XBP1s表达水平明显上升。5.Doxorubicin联合4-PBA,Western blot检测结果显示凋亡相关蛋白CASP8,CASP3,PARP-1切割增强,内质网应激相关蛋白EIF2AK3,ATF4,DDIT3表达水平下降明显。结论1.Doxorubicin能显著抑制FaDu细胞增殖、引起FaDu细胞凋亡。2.Doxorubicin能使内质网应激蛋白ERN1,XBP1s表达升高。3.Doxorubicin能使内质网应激蛋白EIF2AK3,ATF4,DDIT3表达下降。4.本实验证明Doxorubicin参与内质网应激并诱导FaDu细胞的凋亡,但还需要进一步研究肿瘤细胞在内质网应激下的凋亡途径,探索肿瘤发生、进展、转移和耐药的分子机制,为诱导肿瘤的凋亡和逆转肿瘤耐药提供新的方向。