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目的:克隆、表达猬迭宫绦虫27kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine Protease,CP)基因,优化原核表达条件,并应用免疫荧光技术检测27kDa-CP在成虫、裂头蚴不同组织中的分布情况。方法:(1)根据NCBI中公布的猬裂头蚴27kDa半胱氨酸蛋白酶基因序列(27kDa-CP,D63670),提取蛇源猬裂头蚴总RNA,逆转录合成cDNA,应用PCR技术对目的片段进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a(+),构建pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒,转入大肠埃希菌Transetta(DE3)中,观察在不同培养时间、不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及不同培养温度条件下27kDa-CP重组蛋白的表达情况。用镍离子柱亲和层析法纯化目的蛋白,表达产物用SDS-PAGE及Western Blotting进行分析。(2)用纯化后的重组27kDa-CP蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体(一抗),用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG作为二抗,对27kDa-CP在猬迭宫绦虫成虫、裂头蚴组织中的位置分布进行免疫荧光定位。结果:(1)pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒经IPTG诱导后,蛋白在大肠埃希菌Transetta(DE3)中成功表达,最适表达条件为:培养温度30℃,IPTG浓度为0.3mmol/L,培养时间为18h。重组蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后测得其浓度为0.2mg/mL。(2)纯化后的重组蛋白经Western Blotting检测,其相对分子质量大小(Mr)约为35kDa,与预期大小相符,且能被重组蛋白免疫小鼠血清识别。(3)免疫荧光定位显示27kDa-CP在裂头蚴皮层及排泄管中呈高度表达;在成虫中,以节片(孕节和成节)子宫内虫卵卵壳的表达最强,其次为排泄管道及皮层。结论:(1)成功构建了猬迭宫绦虫27kDa-CP基因原核表达体系,通过表达条件的优化,在大肠埃希菌Transetta(DE3)中27kDa-CP重组蛋白可获得高效表达。(2)通过免疫荧光技术组织定位初步提示27kDa-CP可能参与了虫体的入侵、移行、营养吸收、排泄、免疫逃避、生长发育及生殖等过程。