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水稻(Oryza sativa)是我国最主要的粮食作物之一,在粮食安全中发挥着非常重要的作用。褐飞虱(Nilaparvata lugens,brown rice planthopper,BPH)是我国水稻生产上的重要害虫,严重影响水稻的产量和品质。培育抗虫品种被认为是防治BPH的最佳途径,但BPH致害能力的高度可塑性使传统的抗性育种和应用不能持续控制该虫害,因此,防治BPH危害的关键是不断发现并利用新型有效的抗BPH基因来进行抗性新品种培育。植物遭受植食性昆虫侵害时能够产生诱导抗虫反应,其分子机理一直是研究热点。植食性昆虫侵害诱导植物中大量基因的转录水平发生变化,转录因子在植物中起着重要的作用。bHLH转录因子家族是植物转录因子中最大的家族之一,普遍地参与了植物的生长发育以及应对生物和非生物胁迫,但其在水稻应答BPH危害过程中的调控机理尚不明确。实验室前期利用了 GatewayTM大规模克隆技术,把水稻转录因子构建到转录激活因子与转录抑制因子上,通过遗传与转化获得了 57,751份分别带有转录因子功能获得和功能丧失的独立转基因水稻株系。基于实验室前期通过苗期集团筛选法进行抗虫性筛选,发现OsbHLH35转录因子表达激活的转基因水稻材料V1188对BPH表现出高度的感虫性,且该转录因子对应的表达抑制材料E1188对BPH的抗性不明显,初步推断V1188为感虫材料。因此,本研究以OsbHLH35转录因子为研究对象,以OsbHLH35表达激活的转基因水稻V1188为试材,对OsbHLH35转录因子在诱导水稻抗BPH中的作用及调控机理进行了初步研究。主要结果如下:1.基于前期实验室筛选结果,我们采用普通PCR技术,验证了V1188和E1188为正确的转基因材料。通过潮霉素筛选证实OsbHLH35转录因子表达激活材料V11886、V11889和V118810为OsbHLH35转录因子表达激活的转基因纯合株系,可用于下一步的实验。通过表型观察发现,V11886、V11889和V118810与野生型水稻品种Kitaake(KTK)相比,在水稻种子萌发和株高方面无明显差异。但是三个转基因株系的根长与KTK相比均降低了 42%左右,表明OsbHLH35转录因子在水稻中表达激活后抑制了水稻的根长,该基因是否是通过调控水稻根长从而影响水稻抗虫性还有待进一步研究。2.利用实时荧光定量PCR技术,对水稻不同组织和不同时期的OsbHLH35转录因子的表达量进行分析。结果显示,OsbHLH35基因在野生型KTK的四叶期和分蘖期叶鞘中的表达量最高。V11886、V11889和V118810叶鞘中OsbHLH35基因表达量约是KTK的13倍。此外,经过BPH取食后,OsbHLH35基因在V11886、V11889和V118810中高表达,分别是KTK的12.6、13.5和18.7倍。由于BPH通过叶鞘取食对水稻进行为害,OsbHLH35转录因子在叶鞘中高表达暗示其可能在BPH取食过程中起作用,从而影响水稻对BPH的抗性。3.抗虫性生物学测定,结果显示V11886、V11889和V118810株系上BPH分泌的蜜露面积大约是KTK的2倍,V11886、V11889和V118810株系上BPH存活率在第7天时为80%左右,而KTK仅为67%,同时V11886、V11889和V118810株系上BPH群体生长率大约是KTK的1.4倍。表明BPH更喜欢在OsbHLH35转录因子表达激活材料的三个株系上取食和活动,暗示OsbHLH35转录因子可能抑制了水稻的趋避性防御机制,反向调控了水稻对BPH的抗性。4.BPH 取食后,相较于 KTK,V11886、V11889 和 V118810 材料中的茉莉酸(jasmonic acid,JA)途径的关键合成基因AOS2和LOX的表达量分别显著下降了 83%、74%、64%和76%、64%、55%。此外,V11886、V11889和V118810中的植物防御酶—多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)的酶活性在BPH取食后,与KTK相比,也分别下降了 50%、44%、48%和 35%、45%、48%。上述结果表明,OsbHLH35转录因子可能通过抑制褐飞虱取食对水稻AOS2和LOX基因表达的诱导效应来抑制JA信号途径,同时抑制水稻体内主要防御酶PPO和PAL的活性从而削弱水稻的抗虫防御能力,说明OsbHLH35转录因子可能是水稻抗BPH反应中的一个负调控因子。研究结果可以为水稻的抗BPH育种及防治BPH提供一定的理论依据。