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背景与目的恶性肿瘤已成为人类死亡的主要原因之一，每年全世界约有700万人死于癌症。食管癌（esophageal cancer，EC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发生在食管上皮细胞，其发病较隐匿、进展快、预后差，具有显著的地域性分布差异。在世界范围内其发病率位于恶性肿瘤的第六位，在中国则位于第四位。我国是世界上食管癌的高发国家，世界上70％左右的食管癌发生在我国，是目前世界上死亡率最高的国家之一。积极预防及治疗食管癌对于提高人民的健康水平及促进社会经济的发展具有重要的意义。虽然经过多年的基础研究和临床实践，食管癌患者的生存率并没有得到根本的改善，严重威胁着人民的生命和健康。因此，寻找行之有效的干扰食管癌发生和发展的线索和物质成为广大学者关注的重要课题。流行病学资料显示，不良饮食为食管癌的诱因之一，并且现已证明人们所摄取的食物中有促癌成分也有抗癌成分，因此寻找食物中的抗癌成份进行食管癌的预防及治疗具有十分重要的意义。食管癌患者常常伴有免疫功能低下，加上手术创伤等，术后短期往往不能耐受毒性较大的化疗药物的应用。因此，食管癌术后患者应该应用一些性质较温和的既具有抗癌作用又能提高免疫功能的药物。目前，众多学者主要着眼于从天然产物中寻找新的化学药物。植物化学物为植物性食物中天然存在的、含量较少的一类具有抗突变、抗癌或其它生理活性的化学物质。近年来对其的研究成为食品化学／营养学在抗肿瘤方面研究的热点。叶黄素（lutein）是一种天然植物提取物，属于含氧类胡萝卜素。国外大量的流行病学证据表明，叶黄素在预防视黄斑退化、阻断肿瘤、心血管疾病的发生与发展和增强机体免疫力等方面都有着广泛的生物学活性。在我国，叶黄素的应用仅仅局限于饲料行业，其生物学活性和生物学效应研究尚未引起食品和医药行业的重视。国内学者王明臣等研究证实lutein具有明显的抗氧化、抗衰老和抗突变等生物学效应。本课题拟在前期研究的基础上，以人食管癌细胞株EC9706细胞作为研究对象，利用生化及分子生物学技术，旨在探讨lutein对EC9706细胞的增殖抑制和诱导分化效应及其分子机制，期望为食管癌的干预阻断防治提供新的线索和途径。材料与方法1．常规培养人食管癌细胞株EC9706细胞，测定并绘制该细胞株的生长曲线及标准曲线。2．MTT比色法测定EC9706细胞的增殖活性，用不同浓度叶黄素作用EC9706细胞，计算细胞增殖抑制率。3．HE染色法观察叶黄素作用后EC9706细胞形态的改变。4．酸解DNA甲绿—派朗宁染色并计数经叶黄素作用食管癌分化细胞／增殖细胞的比例，观察叶黄素对EC9706细胞分化的影响。5．采用流式细胞法测定叶黄素作用EC9706细胞后细胞周期的改变及凋亡情况；免疫组织化学法测定叶黄素对EC9706细胞Bcl-2与Bax蛋白表达的影响，以及叶黄素对EC9706细胞周期素Cyclin D1与Cyclin E蛋白表达的影响。6．所有实验数据采用SPSS 10.0 for windows统计软件分析处理。多组间的比较采用单因素方差分析，组内两两比较用LSD检验。率的比较采用卡方检验。P＜0.05差异具有显著性。结果一、叶黄素对人食管癌细胞株EC9706细胞增殖的抑制作用1．叶黄素对EC9706细胞的形态学改变1．1倒置显微镜下活细胞观察：叶黄素高浓度组细胞浓度下降，除部分细胞体积缩小，胞浆胞核浓缩外，多数细胞变形，呈现梭形改变。随叶黄素浓度及作用时间的增加，细胞毒性改变更趋明显。1．2 HE染色光学显微观察：镜下观察可见阴性对照组EC9706细胞较圆，核显蓝紫色深染，胞浆淡蓝紫色，细胞核大，胞浆少，胞核比增大，呈现典型恶性肿瘤细胞特征；而叶黄素处理组细胞多呈椭圆形或不规则形，大部分核深染程度较轻，胞浆多且淡染，呈浅紫红色，细胞核小，核浆比增大，个别发生空泡变性。细胞形态发生明显变化，呈现梭形细胞等上皮细胞形态，提示叶黄素诱导其成熟分化，细胞恶性程度降低。2．叶黄素对EC9706细胞生长曲线的影响阴性对照组食管癌细胞的生长曲线随着时间的延长呈现显著的上升趋势。而不同浓度叶黄素组处理EC9706细胞一定时间后细胞的生长曲线均明显低于阴性对照组（p＜0.05），呈现一定的剂量和时间依赖性。其中80μg／ml和160μg／ml叶黄素组96h食管癌细胞的存活率分别为57.77％和45.57％。3．叶黄素对EC9706细胞增殖指数（PI）的影响与阴性对照组相比，叶黄素作用EC9706细胞96h后，各剂量组的细胞增殖指数明显降低（p＜0.05），并呈时间和剂量依赖性。二、叶黄素对人食管癌细胞株EC9706细胞分化的诱导作用叶黄素干预处理EC9706细胞72、96h后，酸解DNA甲绿—派朗宁染色显示，和阴性对照组相比，叶黄素组增殖型细胞明显降低（p＜0.05），并且增殖型细胞／分化型细胞的比值随着叶黄素浓度的升高而降低。三、叶黄素对人食管癌细胞株EC9706细胞周期阻滞作用1．叶黄素作用后EC9706细胞周期的改变从细胞周期各时相分布来看，经叶黄素各组作用后，G0／G1期细胞比例明显增多，而S期细胞比例逐渐减少，G2／M期细胞分布比例也有减少的趋势。统计分析结果显示叶黄素各组对EC9706细胞系的细胞周期均有明显影响（P＜0.05）。2．叶黄素作用后EC9706细胞周期素Cyclin D1与Cyclin E的表达叶黄素处理EC9706细胞96h后，经过免疫组化测定，食管癌细胞Cyclin D1蛋白表达降低，而阴性对照组表达水平较高，两者相比差异具有显著性（p＜0.05）；Cyclin E蛋白在阴性对照组食管癌细胞中表达水平较高，经叶黄素干扰处理的EC9706细胞中Cyclin E表达明显降低，统计学处理有显著性意义（p＜0.01）。四、叶黄素对人食管癌细胞株EC9706细胞的凋亡诱导作用1．DNA倍体分析：叶黄素作用后EC9706细胞96h后，叶黄素组EC9706细胞在流式细胞仪DNA直方图上可见明显的亚二倍峰体（凋亡峰，Ap），而阴性对照组在二倍体峰前见微量亚二倍体峰。2．叶黄素作用后EC9706细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达实验中叶黄素处理组与阴性对照组Bcl-2和Bax蛋白均有表达，96h后，对照组Bcl-2蛋白表达的细胞数量多，颜色深，呈强表达，而叶黄素处理组阳性细胞表达色泽浅，呈弱表达，对照组与叶黄素处理组差异有显著性（P＜0.05），表明叶黄素可以下调食管癌EC9706细胞Bcl-2蛋白的表达。而正常对照组少数细胞Bax蛋白表达且色泽浅，呈弱表达，叶黄素组表达的细胞数量多，颜色深，呈强表达，对照组与叶黄素处理组有显著性差异（P＜0.05），揭示叶黄素诱导EC9706细胞Bax蛋白的表达。结论1．MTT试验结果提示叶黄素在体外具有抑制人食管癌细胞株EC9706增殖的作用，且具有时间剂量依赖性。2．HE染色以及酸解DNA甲绿-派朗宁染色显微镜下观察提示叶黄素可以诱导人食管癌细胞株EC9706细胞分化。3．流式细胞术分析显示，叶黄素可以明显干预人食管癌细胞株EC9706细胞的增殖周期，将EC9706细胞阻滞于G0／G1期，其机制可能系叶黄素降低了食管癌细胞周期调节关键蛋白Cyclin D1与Cyclin E蛋白的表达。4．流式细胞术分析显示叶黄素可以诱导人食管癌细胞株EC9706凋亡，其机制可能系Bcl-2蛋白下调和Bax蛋白上调所介导的。