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最关键的问题是常规抗体的分子量大和复杂的天然构象，以及利用哺乳动物细胞生产费用都会影响mAbs片段的发展。重组抗体片段的小型化，例如Fabs(～57KDa)、单链Fv片段(scFv，25KDa，VH区域与VL区域通过多肽链联接在一起)和scFv二聚体，包括双体、三体、四聚体、五聚体和十聚体等多种形式可以选择。这些片段保留了抗体的特异性，易于制备，可以广泛的应用于诊断和治疗[14]。 除了上述重组抗体片段，从骆驼科（美洲骆、骆驼等）和软骨类鱼（鲨鱼）发现的更小的抗原结合片段只包含重链可变区。这些重链抗体的抗原结合位点是由单一的可变区组成，称为VHH（骆驼）和VNAR（鲨鱼）(Figure2)。VHH和VNAR易于表达，重组抗体的分子量为10～15KDa，称为单域抗体(sdAbs)[15]。sdAbs是最小的完整的抗原结合片段，直径为2.5nm，高大约4nm[16,17]。sdAbs的小分子量、抗原特异性比常规抗体具有明显的优势，随后将进一步讨论这些优势。 VHHs和VNARs组成重链的可变区，两个恒定区（CH2和CH3）与经典抗体恒定区Fc段相同[14，18，19，20]。VHHs和VNARs包含三个CDRs（常规抗体又六个），有多个不同的环状区域可以结合目标抗原。无论是结晶[21，22]还是溶解[23，24,25]状态，VHHs可变区的结构呈b-片层构象，这一点与常规抗体的VH和VL免疫球蛋白相一致。骆驼VHHs的互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)在线性构象上有很大的不同，CDR3(长度为16-18个氨基酸)比人（12个氨基酸残基）或鼠（8个氨基酸残基）的CDRs长一些。Desmyter et al.报道过2.5A分辨率骆驼VH[26]，cAb-Lys3，与鸡卵清蛋白中的溶菌酶复合物的晶体结构，cAb-Lys3突出的CDR3环70％参与抗原的作用，这样可以弥补VL域缺乏。因此，CDR3环突出部分可以在作用更深入一些，可以结合溶菌酶抗原洞底端。这表明骆驼VH域可以与抗原形成稳定的复合物，能够识别常规抗体无法识别的深藏的抗原表位。 与其他抗体和它们的片段相比，VHHs更大的特点可逆性的折叠。与其他的抗体热变性不同，VHHs即使在高温（80-92℃）处理后，仍具有高的热稳定性和抗原结合特性。VHHs的熔点范围为60-78℃，拆分自由能(△GN-U)从21-57 kJmol-1，明显高于人可变区的自由能（14-35 kJmol-1）。据报道，VHH在高盐、蛋白酶、极端pH等条件下也是相当稳定，这使得VHHs在极端环境和高温下维持生物活性。 VHHs在细菌中易于表达和纯化，产量高，可以通过噬菌体展示技术产生。第一个VHH抗体库由免疫鼠的脾细胞分离[39]。随后，Davies等开发了第一个VHH噬菌体展示库[31]，并且从免疫库中分离出骆驼化的VHHs[40]。除了噬菌体展示以外，还有核糖体展示[41]、酵母展示[42]、DNA转换[43]等技术均能应用于发展VH和VL库，用来筛选抗原结合物。 同源抗原的抗体片段显示不足之处在于抗体亲合力较低（可能由于缺乏FV的另一部分），几种不同的体外方法可以提高抗体的亲合力，其中包括多聚化策略，例如:error-pronePCR、产生细菌变异株、CDR转换等。然而，VHHs严格的单显性特性可以在抗原表面封闭表位，尤其是肿瘤的密集组织。进一步讲，基于抗体的分子量和大小，VHHs能强力中和蛇毒中的毒素物质，具有中和毒素作用相似的药物动力学。 单域抗体的特异性和制备成本低使其更适合于抗体介导的疾病诊断。然而，据报道，即使高亲和力重组抗体片段与目标抗原有适当的存留时期，同时由于分子量小，血清清除很快。因此由非免疫噬菌体体分离的抗体片段的KD通常较低，范围在10-8～10-9之间，不适用于治疗。 在早期描述中，几种亲和突变技术的应用增强抗体的亲合力，多聚化是其中最好的办法。通过增强对体内目标效率以及增加血中的停留时间的能力，多聚化形式能大大的增强单域抗体的治疗效果。通过区域互换，基因的线性融合及化学偶联等多聚化技术可应用于连接单一区域形成多价抗体。 我们利用卷曲蛋白（COMP48，人类软骨寡聚基质蛋白48个氨基酸）与单域抗体融合表达，形成五聚体形式，称为“combody”。首先，从骆驼单域噬菌体抗体文库中利用RABV-G蛋白固相结合筛选出单域抗体。我们选择并表达一些狂犬病毒G蛋白特异性的单域抗体，同时也制备了一些五聚体，2602，2603，26424 and26434。BR2.3作为单域抗体单体形式对照。 单体和五聚体combody均可在原核表达系统中进行表达。2602，2603，26424和26434的五聚体形式可以用分子筛层析进行确证(Figure13A，B，C and D)。在非还原的条件下，2602，2603，26424和26434呈现的分子量为130kDa左右，表明链间二硫键是多聚体形成的重要原因。在还原条件下，2602，2603，26424和26434显示分子量为25kDa左右（分子量大小为单域抗体和comp的总和），这也证明二硫键的存在(Figure13E)。相反，单体BR2.3在还原和非还原条件下、在分子筛层析(Sephadex200，GE Healthcare)均显示分子量为14kDa(Figure14A and B)。进一步用Western Blot（抗-myc抗体和辣根过氧化物酶标记的抗-鼠IgG抗体）检测(Figure14C)。 首先，利用包被灭活狂犬病毒抗原结合ELISA法测定，Influenza H1N1作为阴性对照。2602、2603、26424和26434均显示较强的结合特性，用狂犬病毒(CVS-11)假病毒对中和抗体中和病毒活性检验这些抗体的病毒中和能力(Figure15)。 利用CVS-11（狂犬病毒标准实验毒株）假病毒中和试验评估combodies和BR2.3的病毒中和能力。五聚体combodies2602、2603、26424、26434在较低浓度下(蛋白浓度为5.5mg/ml)可中和CVS-11假病毒(6 X105 RLUs)(Figure16A);与之相反，BR2.3在较低浓度下不能抑制狂犬病毒假病毒(7 X103 RLUs)，但在高浓度下(16.6mg/ml)可以中和部分假病毒(Figure16B)。当用16.6mg/ml时，26424和26434可以中和90％-95％假病毒(Figure17)。所有实验均用HRIG作为阳性对照，可以中和90％-95％的假病毒。结果显示多聚化成功地提高了26424和26434在体外的病毒中和能力（约为85倍）。 利用狂犬病毒感染小鼠模型，评估2602、2603、26424和26434五聚体的病毒中和能力。在小鼠中和试验中，用致死剂量的狂犬病毒（CVS-24株）分别与2602、2603、26424和26434五聚体共感染小鼠，同时接种狂犬病疫苗，评估上述五聚体的保护力。 由于同时应用疫苗和ERIG，在阳性对照组没有小鼠死亡。在2602和2603组小鼠的死亡率为80％，在26424和26434组，小鼠的死亡率为50％和60％(Figure18)。结果显示26424和26434两组与阳性对照组相比，有部分病毒中和能力。减少的病毒中和能力可能是由于单域抗体和COMP48的对于小鼠显示的抗原性所致。因此，如前所述，2602(0.2 IU/ml)，2603(0.9 IU/ml)，26434(0.2 IU/ml)和26424(1.6 IU/ml)相对浓度比小鼠中和试验的标准剂量低的多。本实验数据显示单域抗体多聚化能有效地中和狂犬病毒，下一步将在小鼠中和实验中考察提供100％保护力的量效关系。 综上所述，带有人COMP48的多聚化单域抗体显示对目标抗原的高亲合力，并可中和病毒。本研究中分离的多价单域抗体可用于预防狂犬病毒感染以及研究病毒感染机制等。