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本文从以下几个方面进行论述： 第一部分:miR-155调控TNF-α诱导HUVECs细胞衰老和细胞增殖的分子机制研究 1.研究背景: 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、脑梗死和外周血管病的主要病理过程。炎症在动脉粥样硬化各个阶段都具有重要的调节作用。此外，促炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是动脉粥样硬化发生发展的一个重要危险因素，并且可以通过炎症反应诱发心血管事件的发生。血管内皮细胞的形态损伤和功能障碍在动脉粥样硬化的发生和发展中起到了重要作用。 体外研究结果提示，miR-155调节不同类型细胞中与炎症相关的基因表达;在体内，miR-155影响动脉粥样硬化的发生发展。因此，miR-155可能与动脉粥样硬化的发病机制密切相关。尽管SIRT1和miR-155在内皮功能调节中起重要性，但它们之间的关系以及炎症对动脉粥样硬化中内皮功能的调节作用尚不清楚。 2.研究目的: 本研究旨在探索SIRT1与miR-155之间的关联，研究miR-155在调节心血管动态平衡中的重要作用，并探讨辛伐他汀(simvastatin，SIM)与缬沙坦(Valsartan，VAL)对细胞衰老的调控作用。 3.研究方法: (1)细胞模型和药物干预模型的构建 1)“TNF-α”细胞模型的构建:细胞模型主要包括正常对照组(Control组，CTL组)和“TNF-α”刺激组(TNF-α组)。两组的基础培养基均为内皮专用培养基(endothelial cell media，ECM)。“TNF-α”细胞模型实验中都采用同一种刺激方式，用含有20 ng/ml TNF-α的ECM培养基分别培养细胞8小时。 2)缬沙坦(Valsartan，VAL)和辛伐他汀(simvastatin，SIM)的药物干预模型:我们统一用40μM的VAL和1μM的SIM对TNF-α组的HUVEC细胞进行干预。我们先用40μM的VAL和1μM的SIM作用于HUVEC细胞3小时，随后使用20 ng/ml TNF-α刺激细胞8小时。 (2)细胞转染: 1)siSIRT1的细胞转染 本实验中，我们用lipofectamine RNAiMAX试剂完成siSIRT1的转染; 2) miR-155 mimics和inhibitor的转染 本实验中，我们用lipofectamine3000试剂完成miR-155 mimics和inhibitor的转染; (3)细胞总蛋白的提取、蛋白定量分析和Westernblot实验: 1)我们采用美国Thermo Fisher Scientific公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白的定量分析; 2)用特异性抗体检测细胞内SIRT1、乙酰基化的p53(Ac-p53)、total p53、乙酰基化的Foxo-1(Ac-Foxo-1)、 totalFoxo-1、p21和SMP-30等分子靶标的表达水平; 4.研究结果: (1)TNF-α上调HUVECs中miR-155的表达 TNF-α(20ng/mE)显著上调了miR-155的表达。早在2小时后miR-155表达开始增加，在6小时时miR-155表达达到高峰; (2)TNF-α下调HUVECs中SIRT1蛋白的表达 与对照组相比，20ng/mL的TNF-α作用于HUVECs后的SIRT1蛋白表达水平降低。同时我们发现，与对照组相比，TNF-α刺激HUVECs后的SIRT1 mRNA水平无显著统计学差异; (3)HUVEC中，miR-155介导TNF-a引起的SIRT1表达下调 过表达miR-155后SIRT1的蛋白表达减少;在TNF-α刺激或基础条件下，抑制miR-155后SIRT1蛋白表达增加，这充分表明在HUVEC中miR-155的下调可以增加SIRT1蛋白水平; 5.研究结论: 功能分析显示，miR-155抑制剂降低TNF-α介导的内皮衰老并增加细胞增殖。也证实miR-155抑制剂在基础条件下同样可以增强SIRT1蛋白水平的表达，表明在生理条件下SIRT1蛋白表达同样受miR-155调节。在未来的研究中，深入探索miR-155在心血管疾病进展中的保护机制有利于我们进一步阐明心血管疾病的发病机制，而继续研究辛伐他汀或缬沙坦的作用靶点和作用机制，则有助于我们发现新的分子靶标和诊疗策略; 第二部分:脑心通胶囊对TNF-α诱导HUVECs细胞衰老的保护机制研究 1.研究背景: 步长脑心通胶囊选用黄芪，丹参，赤芍，川芎，四川地黄，桃仁，乳香，红花丹参，没药，鸡血藤，牛膝，桑枝，桂枝、蚯蚓，蝎子和水蛭等种中草药，具有补气活血通络之效，广泛应用于心脑血管疾病的一、二级预防，临床疗效显著。大量的研究表明，脑心通胶囊对治疗脑梗塞、冠心病心绞痛、糖尿病并发症等方面疗效显著。然而尚无研究阐述步长脑心通胶囊与TNF-α诱导的细胞衰老现象之间的潜在联系。 2.研究目的: 本研究拟探讨SIRT1与TNF-α诱导内皮衰老的内在联系。此外，我们还要研究步长脑心通胶囊是否具有抗细胞衰老现象的药理作用。 3.研究方法: (1)细胞模型和药物干预模型的构建: (2)制备脑心通肠溶液 (3)细胞转染: siSIRT1的细胞转染:本实验中，我们用lipofectamine RNAiMAX试剂完成siSIRT1的转染; 4.研究结果: (1) TNF-α通过SIRT1/FoxO-1/p53/p21通路诱导内皮衰老: 与对照组相比，TNF-α组显著增加SAβ-Gal染色阳性细胞的百分比，细胞内SIRT1表达的下调伴随着Ac-FoxO-1，Ac-p53和p21蛋白表达的增加; (2)脑心通增加TNF-α刺激后的细胞活力: 将细胞用不同浓度的脑心通小肠吸收液预处理6小时后，接着用TNF-α刺激8小时，结果显示脑心通小肠吸收液显著增加了TNF-α刺激后的细胞活力; (3)脑心通逆转TNF-α诱导的内皮细胞衰老现象: 与对照组相比，用TNF-α处理的内皮细胞中SAβ-Gal染色阳性细胞的百分比增加。然而，与TNF-α组相比，用脑心通干预过的实验组表现出SAβ-Gal染色阳性细胞的百分比降低; 5.研究结论: 我们的数据表明，TNF-α诱导的氧化应激减少了SIRT1的表达，伴随着FoxO-1/p53/p21介导了细胞的加速衰老。此外，脑心通通过SIRT1轴减弱了TNF-α的作用，从而延缓了TNF-α诱导的内皮衰老。因此，我们认为脑心通通过调节SIRT1/FoxO-1/p53/p21通路，可以作为抗TNF-α诱导内皮衰老的治疗药物，从而进一步防止动脉粥样硬化的持续进展; 第三部分:高糖刺激引发内皮细胞衰老“代谢记忆”现象的分子机制研究 1.研究背景: 二甲双胍是治疗2型糖尿病使用最广泛的口服降血糖药物。白藜芦醇是一种发现于葡萄皮以及其他植物中的酚类活性物质，是SIRT1的激动剂，具有细胞内抗氧化活性作用。尽管之前的研究表明二甲双胍和白藜芦醇能够抑制高糖诱导的内皮细胞衰老，然而，两者是否可以改善细胞衰老的“代谢记忆”现象尚未明确阐明。 2.研究目的: 本研究拟探索SIRT1介导的p53乙酰化与内皮细胞衰老的“代谢记忆”现象之间的相互关系，并深入探究二甲双胍与白藜芦醇是否可以抑制细胞衰老的“代谢记忆”现象。 3.研究方法: (1)细胞模型和药物干预模型的构建: (2)细胞转染: 1) siSIRT1和si-p300的细胞转染:本实验中，我们使用lipofectamineRNAiMAX试剂完成siSIRT1和si-p300的转染; 2) SIRT1质粒的细胞转染:本实验中，我们使用lipofectamine3000试剂完成SIRT1质粒的转染; (3)细胞总蛋白的提取、蛋白定量分析和Western blot实验: 1)我们采用美国Thermo Fisher Scientific公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白的定量分析; 2)用特异性抗体检测细胞内SIRT1、p300、乙酰基化的p53(Ac-p53)、totalp53、p21和SMP-30等分子靶标的表达水平; 4.研究结果: (1)短暂的高糖刺激可引发持续的内皮细胞衰老 (2)短暂的高糖刺激通过改变SIRT1/p300/p53/p21和下游信号靶标的改变引发持续的内皮衰老 5.研究结论: 总之，本研究中，我们证实了内皮衰老（衰老“记忆”）的“代谢记忆”的存在，即短暂的高糖刺激可引起HUVEC的持续衰老。SIRT1/p300/p53/p21信号通路是介导短暂高糖刺激诱导内皮衰老“记忆现象”的重要机制。其中，由SIRT1和p300的稳态失衡所引发的p53的乙酰化修饰是细胞衰老“代谢记忆”现象的新的表观遗传机制。此外，二甲双胍和白藜芦醇通过影响SIRT1/p300/p53/p21信号通路逆转细胞衰老的“血糖记忆”现象。