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中药制剂历经千百年的临床应用,其有效性和安全性得到了广泛的认可,然而近年来有关中药及其制剂安全性问题的报道呈逐年上升趋势。其中,何首乌所致肝毒性问题越来越引起广泛的关注。中药何首乌为蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb)的干燥块根,具有抗炎、抗衰老、抗氧化以及抗癌等功效。研究发现,何首乌中所含的蒽醌类物质如大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等为造成肝损伤的主要成分。何首乌致肝损伤最常见的症状之一为胆汁淤积,但是何首乌引起胆汁淤积的机理并不明确。鉴于胆汁酸转运体和代谢酶在胆汁酸稳态平衡中发挥的重要作用,本研究从胆汁酸转运体和代谢酶两方面研究何首乌引起胆汁淤积的机理。首先,建立了大鼠原代肝细胞“三明治”培养模型,利用其特有的胆管结构,分别选择外源性胆汁酸 deuterium-labeled taurocholate(d5-TCA)、deuterium-labeled glycochenodeoxycholic acid(d4-GCDCA)和(and6)-carboxy-2’,7’dichlorofluorescein(CDF)作为底物,考察大黄素、大黄酚、大黄素甲醚以及三化合物合用短期(30 min)和长期(24 h)对胆汁酸在肝细胞以及胆管中累积量的影响。经30 min孵育后,大黄素可显著降低d5-TCA和d4-GCDCA的胆管底物外排指数(Biliary excretion index,BEI),提示其可抑制胆汁酸输出泵(bile salt export pump,BSEP);而大黄酚可显著降低CDF的BEI值,提示其可抑制多药耐药蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,Mrp2)。摄取实验结果表明,大黄素可抑制钠离子依赖型牛磺胆酸协同转运蛋 白(Na+/taurocholateotransporting polypeptide,Ntcp),且对其摄取 d5-TCA 的抑制程度大于d4-GCDCA。d5-TCA在肝细胞和胆管中总累积量随大黄素浓度增大而降低,说明大黄素对Ntcp的抑制作用大于对Bsep的作用;而对于d4-GCDCA,因大黄素对Ntcp的抑制作用小于对Bsep的抑制,使其肝细胞和胆管中累积量减少。大黄素、大黄酚、大黄素甲醚以及三种化合物合用均可使CDF在肝细胞和胆管中总累积以及肝细胞中的累积量显著增加,提示上述化合物均可抑制基底侧转运体多药耐药蛋白 3(multidrug resistance-associated protein 3,Mrp3)。基底侧外排实验结果表明,这三种蒽醌类物质可显著增加d5-TCA和d4-GCDCA在肝细胞和胆管总累积量,同样证明了其对基底侧外排转运体的抑制。除Mrp3外,Mrp4以及有机溶质转运体α/β(organic solute transporter α/β,Ostα/β)等多种基底侧外排转运体也可能被上述蒽醌类物质抑制。当联合给予三种蒽醌类化合物时,在1μM时可显著增加肝细胞和胆管中d5-TCA、d4-GCDCA和CDF累积量,提示具有一定的协同作用。对胆管侧外排转运体Bsep、Mrp2和基底侧外排转运体的同时抑制可明显增加肝脏中胆汁酸累积的风险。为了考察三种蒽醌类物质对胆汁酸转运体的表达以及肝细胞和胆管中底物累积的影响,本文进一步采用长期孵育实验。在孵育24h后将蒽醌类物质移除,以排除对转运体功能的影响。大黄素以及三化合物合用可增加肝细胞和胆管中d5-TCA、d4-GCDCA和CDF总累积量。荧光定量PCR和western blot实验结果表明其与基底侧外排转运体Mrp3和Mrp4蛋白表达减少相关。但是,大黄酚可上调Mrp4基因和蛋白的表达,导致肝细胞和胆管中d5-TCA和d4-GCDCA总累积量减少。大黄素甲醚可增加肝细胞中CDF累积量,可能与Mrp3表达减少有关。同时,三种蒽醌物质均可显著增加胆管外排转运体Bsep的表达,从而导致d5-TCA和d4-GCDCA的BEI值升高。大黄素、大黄素甲醚以及三化合物合用可显著降低Mrp2的表达,而大黄酚可增加Mrp2的表达。此外,Ntcp的表达均可被这三种蒽醌类物质抑制。本文通过测定肝细胞中内源性胆汁酸累积量考察蒽醌类化合物对胆汁酸转运体与代谢酶功能和表达的影响。结果表明,大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和三种化合物合用可显著增加肝细胞和胆管中TCA、TMCA、GMCA和总胆汁酸累积量,此外,毒性相对较大的GCDCA和GCA的累积量在三种蒽醌类化合物合用的影响下也显著增加。为了进一步阐明三种蒽醌类物质对胆汁酸摄取转运体NTCP与外排转运体BSEP的影响,本研究利用表达有人BSEP的膜囊泡和过表达NTCP的HEK-293细胞,考察了大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对BSEP和NTCP摄取不同胆汁酸的影响。结果显示,大黄素对NTCP和BSEP膜囊泡摄取胆汁酸,尤其是结合型胆汁酸都具有一定的抑制作用。其中,大黄素对NTCP介导的TCDCA摄取以及BSEP介导的GCA摄取的抑制作用最强,IC50值分别为9.5、42.2 μM。但是,大黄酚和大黄素甲醚对NTCP与BSEP的抑制作用较弱或无明显作用。整体动物试验分别用大黄素、大黄酚、大黄素甲醚以及何首乌提取物对ICR小鼠进行连续灌胃3天、14天和28天后,采集血样,肝脏组织样本和胆汁。考察血样和肝脏组织匀浆液的生化指标,测定血浆、肝组织匀浆液、胆汁中各种胆汁酸的含量,同时考察肝脏中胆汁酸相关转运体、代谢酶及核受体基因和蛋白水平的表达。HE染色切片结果表明,给药3天后,何首乌组出现了肝损伤情况,随着给药时间的延长,损伤程度不断加重;大黄素甲醚组在给药14天后出现损伤;大黄素和大黄酚组在给药28天出现损伤。但是,血浆中生化指标未发生显著变化,提示其对何首乌引起的肝损伤不敏感。对小鼠体内胆汁酸变化的考察发现,当给药时间为3天时,何首乌组小鼠胆汁和血浆中总胆汁酸减少,而肝脏中总胆汁酸显著增加;给药14天后,大黄素甲醚和何首乌组小鼠肝脏中总胆汁酸显著增加,胆汁中总胆汁酸减少,从而增加了胆汁酸在肝脏中淤积的风险,这与HE染色切片结果一致。给药28天后,四组小鼠肝脏内总胆汁酸虽无显著变化,但结合型胆汁酸的比例显著减少且毒性胆汁酸LCA的量显著增加。在所有产生肝损伤的组别中,均可见胆汁和肝脏中磺酸化LCA的比例显著升高,可作为蒽醌及何首乌引起肝毒性的一个特征性变化。本实验采用偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)多维统计方法进行分析,结果显示各给药组与对照组之间具有一定程度的差异,且胆汁和肝脏中胆汁酸体现出的差异较血浆中明显,提示血浆中胆汁酸受药物影响变化的灵敏度小于胆汁和肝脏中胆汁酸的变化。综合各得分矩阵投影图结果,发现大黄素甲醚和何首乌引起的胆汁酸变化最为相近,说明何首乌引起的胆汁酸稳态变化可能与其所含的大黄素甲醚最为相关。对ICR小鼠胆汁酸转运体和代谢酶基因和蛋白表达的研究,进一步解释了小鼠体内胆汁酸变化的原因。给药3天后,何首乌给药组与胆管上外排转运体Bsep和Mrp2表达量的降低,胆汁酸合成酶胆固醇7-羟化酶(cholesterol 7-alpha hydroxylase,Cyp7a1)表达增加,Mrp3表达下调均与小鼠肝脏内总胆汁酸增加有关。给药14天,大黄素甲醚和何首乌组Bsep和Mrp2的表达量下调,肝细胞基底侧胆汁酸Ntcp表达量的增多,Cyp7a1表达增多,推测为这两组肝脏中总胆汁酸增加的原因。给药28天后,肝脏经过自身的负反馈调节,各给药组小鼠的Ntcp的表达降低,同时大黄素甲醚和何首乌组Bsep表达量增加,使肝脏中胆汁淤积的情况缓解。本研究表明何首乌所含蒽醌类物质大黄素、大黄酚和大黄素甲醚可通过对胆汁酸相关转运体和代谢酶功能和表达的影响,引起胆汁酸平衡的紊乱,阐明何首乌引起胆汁淤积性肝损伤可能与其有关。