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研究背景：
脑梗死的损害并不仅仅局限于梗死灶及其周围组织，还波及远隔部位，引起继发变性。单纯保护脑梗死灶及其周围组织，而忽视脑梗死远隔部位的治疗将难以取得好的疗效。对缺血脑组织进行保护治疗时，不仅应重视对神经细胞的直接保护，促使病变部位的血流恢复并重新建立血管网，也是神经保护的基本前提。因此，促进病变部位的血管新生不失为神经保护的重要策略。
脑梗死灶周存在血管新生(angiogenesis)已经得到公认，并被认为与脑梗死的预后密切相关且能促进神经再生(neurogenesis)。血管新生受血管生成调节因子的调控，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)、内皮抑素(endostatin，ES)是其中最重要的两个。前者是目前已知的最强的血管生成促进因子，后者则明显抑制血管新生。有研究报道，脑缺血不仅促使梗死灶周VEGF表达升高，诱导新血管生成，还引起远离梗死灶的组织表达VEGF。然而，局灶脑梗死后远隔损害的部位是否存在血管新生甚至神经再生，二者在远隔损害修复中起怎样的作用？尚未见研究报道。
组织蛋白酶B(cathepsin B，CB)是细胞死亡的重要介导因子之一，参与梗死灶周组织损伤特别是凋亡过程。初步研究表明抑制CB能明显减轻脑梗死灶周损害，是有前景的脑保护策略之一。然而，目前尚不清楚CB在脑梗死远隔损害中的作用，也不清楚CB抑制剂脑保护的是否还有除了直接保护以外的机制。最近有研究提示，CB对VEGF和ES的生成也有重要的调节作用，因而有可能可以通过调节CB的活性来促进脑梗死后的血管新生，实现对脑组织的保护和修复。
研究目的：
1.观察成年高血压大鼠皮层梗死灶周和梗死同侧丘脑CB活性的变化，并探讨腹腔注射CB抑制剂Ca-074ME对脑梗死周组织、同侧纹状体外侧带和丘脑腹后核(ventralposterior neuclus，VPN)的保护作用，以及对神经功能恢复的影响。
2.研究ES和VEGF在梗死灶周和梗死灶同侧VPN的血管新生调节中的作用及抑制CB对其生成的影响。
3.初步探讨皮层脑梗死同侧VPN的血管新生和神经再生的发生情况。初步观察抑制CB对梗死灶周和同侧VPN血管新生和神经再生的影响。
材料和方法：
采用雄性S-D大鼠220只，用双肾双夹法复制易卒中型肾血管性高血压大鼠(stroke-prone renal vascular hypertensive rats，RHRSP)模型。造模成功后取148只用双极电凝器闭塞右侧大脑中动脉远端(middle cerebral arteryocclusion，dMCAO)，制作皮层脑梗死模型。随机取60只大鼠在dMCAO术后立即接受Ca-074ME腹腔注射一次(5mg/Kg，溶于1％DMSO)(Ca-074ME组)，另取60只接受等剂量的1％DMSO腹腔注射(DMSO组)，另随机选取40只RHRSP大鼠进行假手术做为假手术对照组。随机抽取部分大鼠进行神经功能评估，神经功能评估采用Bederson评分和走横木试验。dMCAO术后6小时、24小时、3天、7天和14天，随机从两个dMCAO组中各取12只、从假手术组取8只大鼠处死，一半用于组织学检测，另一半用于CB酶活性检测。CB的酶活性检测采用Z-Arg-Arg-AMC做为底物，结果以每分钟每克组织释放的游离AMC的nmol数表示。采用Nissl染色显示组织形态并计算梗死体积，用免疫组织学方法检测并半定量ES、VEGF以及血管内皮标记物vWF和内源性神经干细胞(neurral stem cells，NSCs)的标记物巢蛋白(Nestin)的表达情况。为明确ES、VEGF和CB表达细胞的类型以及ES、VEGF与CB的共定位关系，我们还进行了ES/神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase NSE，成熟神经元的标记物)、ES/胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP，星形胶质细胞的标记物)、VEGF/GFAP、VEGF/神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear proteinNeuN，成熟神经元的标记物)、CB/NeuN、CB/GFAP、ES/CB以及VEGF/CB的免疫荧光双标的检测。同时，为明确ES表达与细胞凋亡的关系，我们还进行了ES与细胞凋亡的标记物--cleaved caspase-3(Asp175)的免疫荧光双标记检测。另外，我们还采用TUNEL法检测了梗死灶周的细胞凋亡。所有图像均使用NIHImage J1.31软件进行分析，正态分布的数据以均数±标准差表示，非正态分布型数据以中位数、四分位数或百分率表示。全部数据均采用社会科学统计软件包(Statistical Package for Social Sciences，SPSS) Windows11.0版进行统计，行单因素方差分析(ANOVA)和非参数检验，比较各组间的差异，P<0.05时，认为有统计学意义。
结果：
CB酶活性：
dMCAO术后梗死灶周围和梗死同侧VPN的CB活性均增高，并呈动态改变：dMCAO术后6小时、24小时、3天、7天、14天，DMSO组梗死灶周CB活性测定值依次为：1.24±0.22、1.03±0.13、0.86±0.15、0.87±0.35、0.76±0.19nmol/g·min；Ca-074ME组为：0.93±0.20、0.87±0.24、0.89±0.27、0.83±0.16、0.79±0.21 nmol/g·min；假手术组为：0.72±0.13、0.67±0.18、0.70±0.11、0.74±0.12、0.69±0.25 nmol/g·min；其中，dMCAO术后6小时和24小时两个时间点，DMSO组与假手术组之间比较，差异有显著统计学意义(P<0.01)，并且，dMCAO术后6小时，Ca-074ME组和DMSO组比较差异也有统计学意义(P=0.012)。
dMCAO术后，梗死同侧丘脑CB活性亦出现变化，在dMCAO术后6小时短暂升高，以后回落，dMCAO术后7天又升高，并在这一时间点，DMSO组的CB活性与假手术组相比，差异具有统计学意义(p<0.05)。(dMCAO术后6小时、24小时、3天、7天、14天，DMSO组、Ca-074ME组及假手术组大鼠丘脑的CB活性依次分别为：0.85±0.28、0.87±0.34、0.69±0.24、0.97±0.20、0.67±0.36和0.79±0.13、0.82±0.22、0.74±0.35、0.81±0.17、0.71±0.27以及0.63±0.10、0.69±0.21、0.65±0.30、0.64±0.18、0.72±0.15)。
脑梗死体积：
腹腔注射Ca-074ME能缩小脑梗死体积(dMCAO术后24小时、3天、7天、14天，Ca-074ME组和DMSO组梗死体积占全脑的体积百分数依次分别为：10.04±2.12、10.28±2.36、8.64±1.55、7.96±1.36和12.96±2.13、13.47±1.61、11.1±1.94、9.70±1.75，前三个时间点，两组比较差异有统计学意义，P值依次为0.037、0.025、0.041。dMCAO术后14天，两组梗死体积比较差异无明显统计学意义，P=0.055)。
神经功能评分：
Ca-074ME能改善皮层脑梗死大鼠的神经功能：dMCAO术后3天的两组的Bederson评分(中位数+/-四分位数)分别为：Ca-074ME组2(1，3) VS DMSO组2(2，3)，两组比较P=0.025； dMCAO术后3、7天，两组的BMT评分(中位数+/-四分位数)分别为：Ca-074ME组4.0(3，4.3)、4.7(3.3，5) VS DMSO组3.0(2，3.7)、4.0(2.7，4.3)，两组在两个时间点两两比较P值分别为0.043和0.040。
梗死灶周细胞凋亡：
TUNEL染色显示，假手术组脑组织检测末见细胞凋亡，dMCAO术后梗死灶周围存在显著的细胞凋亡，在dMCAO术后6小时即出现，到dMCAO术后第3天最明显。dMCAO术后24小时和第3天，Ca-074ME组梗死灶周细胞凋亡均显著低于DMSO组(p值分别为0.046和0.040)。
结论：
1实验性皮层脑梗死灶周及梗死灶同侧丘脑CB活性升高，参与了局部损害形成。CB特异性抑制剂Ca-074ME能减少梗死灶周细胞调亡、缩小脑梗死体积、减轻同侧纹状体和VPN继发变性，并改善神经功能。
2实验性皮层脑梗死灶周ES表达升高，参与调节脑梗死早期的血管新生，并与神经元死亡有关。CB在皮层脑梗死灶周ES的生成中有重要作用，Ca-074ME能降低梗死灶周ES的生成。
3实验性皮层脑梗死后，远离梗死灶的同侧VPN出现VEGF表达，并可能存在血管新生及神经再生。