复苏促进因子Rpf对淡水浮游细菌可培养性的影响

• 作 者: 柳云帆
• 机 构: 西南大学
• 出 处: 西南大学
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 复苏促进因子 浮游细菌 可培养性 活的但不可培养状态 信号分子

自然环境中大量微生物处于VBNC（Viable but Nonculturable）状态，实验室中微生物的可培养性通常不足1％。造成微生物可培养性低的原因很多，其中一个主要的原因是实验室条件下缺乏细胞间交流的信号因子。过低的可培养性已经成为筛选新型天然活性产物的瓶颈。革兰氏阴性菌通常采用小分子化合物作为细胞与细胞间交流的信号分子。在培养基中加入QS（Quorum Sensing）信号系统中的酰基高丝氨酸环内酯（N-acyl homoserine lactones，AHLs）和参与大多数革兰氏阴性菌基因调控的cAMP均能有效提高海水和淡水中浮游细菌的可培养性。但作为生物活性物质重要来源的放线菌属于革兰氏阳性菌，而革兰氏阳性菌通常使用寡肽作为信号分子。复苏促进因子Rpf（Resuscitation promoting factor）是第一个被发现的细菌的细胞因子，在皮摩尔浓度下便能促进休眠期的细菌复苏和生长。Rpf家族蛋白广泛分布于革兰氏阳性菌中，高度保守并具有种间活性。本文通过在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌H₃₇Rv rpfC，经IPTG诱导，Ni²⁺ Sepharose纯化可溶性重组蛋白；同时制备藤黄微球菌在LMM培养基中对数生长中后期上清（含天然Rpf）。纯化后的rRpfC及藤黄微球菌上清均能显著缩短休眠状态的藤黄微球菌低密度接种（100cells／mL）到基本培养基（LMM）中的延滞期。在重庆北碚缙云山黛湖采集水样，测定样品非生物因素：温度15.8℃，pH 7.38，TOC 4.91mg／mL，COD_cr27.5mg／mL。部分水样2％戊二醛固定，PI染色，荧光显微镜535nm激发波长下观察计算得出黛湖浮游细菌含量为1.29x10⁶cells／ml。将样品做10倍梯度稀释，MPN法测得添加rRpfC及藤黄微球菌上清后水样中浮游细菌可培养数量约占细菌总数的0.2％，与对照相当。通过改良的试剂盒法抽提宏基因组DNA及MPN法培养后的细菌总DNA，PCR扩增16S rDNA V3—V5区，DGGE指纹图谱分析发现添加Rpf后细菌多样性增加，添加rRpfC及藤黄微球菌上清有一定差异。通过Rpf介导提高环境微生物的可培养性，有望筛选到之前未曾培养的新菌种，进而筛选新型天然活性产物。