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IFNγ是唯一的Ⅱ型干扰素,它作为宿主受感染前期分泌的“危险”信号分子,能快速警告邻近的细胞和先天性免疫的效应细胞,参与到先天性和获得性免疫反应的起始阶段。本报告通过比较基因组学方法结合分子生物学手段,首次从黑青斑河纯中克隆得到两种干扰素γ(IFNγ)和及其受体结合亚基(IFNGR1)两种亚型的开放读码框序列；通过生物信息学软件分析,了解黑青斑河鲀IFNγ及IFNGR1与其他脊椎动物同源基因的结构异同及进化关系；使用半定量RT-PCR技术分析IFNγ和IFNGR1在黑青斑河鲀鱼体各组织的表达情况；使用原核蛋白表达系统,表达和纯化了黑青斑河鲀两种IFNγ重组蛋白,并利用Western杂交鉴定得到的蛋白；最后,使用黑青斑河鲀两种IFNγ重组蛋白离体孵育免疫细胞,检测重组IFNγ蛋白对头肾细胞下游基因表达量的影响。主要研究结果如下:
1.本研究克隆的黑青斑河鲀两种IFNγ(IFNγ1和IFNγ2)和两种IFNGR1(IFNGR1-1和IFNGR1-2)ORF序列及其所推导的氨基酸序列具有与其他物种同源基因具有相似的长度和分子量。黑青斑河鲀两种IFNγ与其他鱼类IFNγ相似,都具有N-端信号肽序列和C-端IFNγ家族标识序列。此外,IFNγ2 C-端带有类似哺乳动物IFNγ的核定位序列。黑青斑河鲀IFNγ受体结合亚基IFNGR1两种亚型则均为单次跨膜受体,在胞外区有多个保守的半胱氨酸残基,胞内区有JAK1结合位点和STAT1停泊位点。
与其他脊椎动物IFNγ及IFNGR1氨基酸序列同源性分析和进化树分析发现,黑青斑河鲀IFNγ和IFNGR1与红鳍东方鲀同源基因亲缘关系最近,与哺乳动物进化关系最远。RT-PCR分析黑青斑河鲀两种IFNγ和两种IFNGR1基因在鱼体各组织的表达模式,结果显示两种IFNγ表达模式差异较大,两种IFNGR1表达模式差异较小。
2.本研究构建了黑青斑河鲀IFNγ1和IFNγ2成熟肽的原核表达载体,转化并得到重组表达工程菌株,通过对诱导的时间、温度和IPTG浓度的优化,选择以30℃为诱导温度,0.3 mM(IFNγ1)和0.5 mM(IFNγ2)IPTG为诱导浓度,诱导7小时后获得高产量的IFNγ2重组可溶蛋白和IFNγ1重组蛋白包涵体。以抗组氨酸标签的单抗为一抗的Western杂交鉴定纯化和脱盐后的重组蛋白确为黑青斑河鲀两种IFNγ重组蛋白。进一步对包涵体IFNγ1进行了纯化、变性和复性及对IFNγ2进行纯化,得到了黑青斑河鲀两种IFNγ重组蛋白。
3.通过离体孵育和荧光定量PCR技术检测,发现在黑青斑河鲀头肾细胞中,1 ng/ml和10 ng/ml的重组IFNγ1以及10 ng/ml的重组IFNγ2蛋白孵育头肾细胞4小时后均能显著上调ISG15 mRNA水平；对于Ⅰ型IFN的标志性因子MX基因,与其他物种Ⅱ型IFN同源性较高的IFNγ2重组蛋白对该基因无显著性影响,但鱼类所特有的IFNγ1各浓度均能显著性抑制MX基因的表达,表明IFNγ1可能是Ⅰ型IFN起效的负调控因子。黑青斑河鲀IFNγ1和IFNγ2重组蛋白具有其特定的生物学活性,既表现出与之前鱼类研究的IFNγ相同的特点,又显示出一定的功能差异。