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引言研究表明自怀孕第6周至妊娠结束,胎盘中均含有HSC(Hematopoietic stem cell,HSC),且具有细胞数量大,获取便捷,使用过程中不存在伦理问题等优点。目前针对脐血(Umbilical cord blood,UCB)来源造血干/祖细胞(Hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC)的体外扩增临床研究已经取得成功,采用扩增后UCB来源HSPC进行移植可以有效解决HSC数量不足造成的造血恢复延迟等问题,数据表明移植后干细胞较未扩增UCB来源HSPC具有相同植入率。胎盘来源HSC与UCB来源HSC同属于围产期干细胞,研究表明其较UCB来源HSC更为原始,目前国内外尚无针对胎盘来源HSC体外扩增的文献报道。目的本研究旨在通过比较机械处理联合化学酶消化法及AMD3100循环灌注法提取人胎盘来源HSC的效果,构建适用于未来临床应用的胎盘来源HSC分离提取方法,得到来源清楚组份确定的HSC;基于模拟造血微环境的体外扩增理论,探讨UCB中CD34+细胞在间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)共培养体系、UM171联合细胞因子扩增体系以及UM171联合细胞因子与MSC共培养体系三种不同扩增体系下体外扩增效果;依据优化的胎盘来源HSC提取方法,对胎盘来源HSC进行分离提取,并基于模拟造血微环境理论构建的扩增体系对提取得到的CD34+细胞行体外扩增,评价扩增效果及扩增后HSPC功能,为拓展临床HSC来源做出尝试。方法1、健康足月顺产胎盘依照处理方法不同分为两组进行胎盘来源HSPC体外提取:A组(机械处理联合化学酶消化组)、B组(AMD3100循环灌注组),每组处理胎盘5个。A组将胎盘经预处理后解剖成小组织块,采用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗后收集清洗液(命名为A1),采用胶原酶、透明质酸酶、DNA酶对清洗后的胎盘组织块进行消化,并置于100目及200目滤网研磨,收集消化液(命名为A2)。B组采用智能蠕动泵连接脐动静脉,采用生理盐水(Normal saline,NS)NS及含AMD3100的NS分步对胎盘脉管系统行循环灌注,分别收集两次灌洗液(命名为B1及B2)。比较两种方法收集得到各类细胞总数,并分别测定两种方法不同阶段收集得到细胞数量及其流式表型情况;2、采集到的UCB进行磁珠分选后得到纯净的CD34+细胞,脐带剪至小块后采用含有0.2%Ⅱ型胶原酶的DMEM/F12培养基进行消化后,进行贴壁传代培养。UCB来源CD34+细胞及脐带来源MSC分为以下四组进行体外扩增培养10天:A组(对照组)、B组(UM171培养组)、C组(MSC共培养组)、D组(UM171联合MSC共培养组)。四组细胞均采用StemSpan培养基,并添加100 ng/ml干细胞因子(Stem cell factor,SCF),100 ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like trysine kinase 3ligand,FLT3),50 ng/ml促血小板生成素(thrombopoietin,TPO),CD34+按照1×105/孔密度接种于六孔板中,其中B组在培养基中额外添加100 ng/ml UM171,C组采用分离得到的第三代脐血同源脐带MSC作为基质细胞,待贴壁90%融合采用60Co照射,剂量为10Gy,D组在C组实验条件基础上同时添加100 ng/ml UM171,细胞培养10天后比较不同组别间细胞扩增倍数及流式表型和集落培养情况;3、分别将AMD3100循环灌注法收集的NS灌洗液及AMD3100灌洗液经免疫磁珠纯化,采用UM171联合MSC共培养方法分别对纯化后的胎盘来源CD34+细胞进行体外扩增培养,验证其扩增效果及流式表型和集落培养情况。结果1、A组与B组收集得到的TNC分别为(45.19±9.41)×107和(42.69±11.19)×107,二者无统计学差异;收集得到的CD34+细胞数(12.98±3.62)×107和(1.87±0.87)×107,二者比较,p=0.00,具有显著统计学差异;收集得到的CD133+细胞数分别为(1.16±0.61)×107和(1.15±0.63)×107,二者无统计学差异;A组收获的细胞液A1中含有TNC为(6.76±2.13)×107,其中CD34+CD38-比例为(1.14±0.56)%。收获的细胞液A2中含有TNC为(38.44±7.33)×107,其中CD34+CD38-比例为(30.31±10.75)%;B组收获的细胞液B1中含有TNC为(15.11±6.03)×107,其中CD34+CD38-比例为(0.72±0.34)%。收获的细胞液B2中含有TNC为(27.58±11.14)×107,其中CD34+CD38-比例为(5.56±1.78)%;2、分离得到的脐带MSC传代培养后细胞状态良好,流式检测发现其高表达CD105,CD73,CD90,不表达CD14,CD34,CD19,CD45,HLA-DR,SSEA-4含量约在1%,经过诱导培养后可以分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。CD34+细胞在不同条件下体外培养10天后发现,对照组细胞总数扩增3.7倍,CD34+细胞扩增3.5倍,组别间无明显差异。UM171培养组总有核细胞数扩增14倍,CD34+细胞扩增13.5倍;MSCs共培养组总有核细胞数扩增11倍,CD34+细胞扩增10倍;联合培养组总有核细胞数扩增达22倍,CD34+细胞扩增21倍。UM171联合MSCs组得到CD34+CD38-细胞比例为91.49±2.67%,较MSCs及UM171组(分别为(78.11±2.34)%,(87.66±1.48)%)均在显著差异,含UM171培养体系CD133细胞比例较单独MSCs培养组存在差异,扩增后细胞集落培养14天后,各系集落形成良好,UM171扩增组细胞较MSCs扩增组在红系及粒系形成能力方面存在优势。3、胎盘NS灌洗液中CD34+细胞经10d培养后细胞总数扩增17倍,CD34+细胞扩增14倍;胎盘AMD3100灌洗液中CD34+细胞经10天培养后几乎全部死亡。脐血对照组与胎盘NS灌洗组扩增后细胞在TNC、CD34+细胞总数、CD133+细胞总数均存在统计学差异,其中胎盘NS灌洗组CD34+CD38-比例为(82.70±6.89)%;扩增后脐血来源及胎盘NS灌洗液中CD34+各谱系集落形成能力良好,胎盘NS灌洗液中CD34+细胞在粒系形成能力方面较未扩增脐血CD34+细胞存在差异。结论1、机械处理联合化学酶消化法以及AMD3100循环灌注法均可以对胎盘来源CD34+细胞进行有效收集,其中AMD3100循环灌注法在保证细胞收集数量的同时可以有效降低细菌污染风险,并可降低母体组织对胎盘来源HSC的影响,收集得到的CD34+细胞经免疫磁珠分选后纯度较高,较机械处理联合化学酶消化法在收集胎盘来源HSC上具有更大的优势;2、脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可提高CD34+细胞体外扩增效果,UM171在扩增过程中可较好的保持细胞干性,二者联合应用扩增效果最佳,建立的脐带间充质干细胞联合UM171对脐血源CD34+细胞的扩增方法可用于CD34+细胞体外扩增培养。3、经AMD3100循环灌注法收集的NS灌洗液及AMD3100灌洗液中CD34+细胞在脐带MSC联合细胞因子及UM171培养体系中扩增效果存在明显差异,其中NS灌洗液中CD34+细胞扩增效果可达17倍,其中较为原始的CD34+CD38—细胞比例达82%,扩增后细胞集落培养实验表明其具有与脐血来源扩增后CD34+细胞同样的谱系重建能力。AMD3100灌洗液中CD34+细胞在该体系中不能进行有效扩增,其细胞来源及功能尚需进一步研究。