牛胚胎体外生产影响因素及LAMP法快速鉴定胚胎性别的研究

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本试验从屠宰场废弃的牛卵巢表面抽取直径在2~6mm的卵泡的卵泡液,并从卵泡液中分拣出外被多层卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体(COCs),然后对COCs进行成熟培养、体外受精和受精后胚胎的体外培养直至囊胚。随后,以LAMP(环介导恒温扩增)方法为依托对生产胚胎进行性别鉴定,该方法省时、简便、准确率高,具体内容包括以下几部分:1.EGF对牛卵母细胞体外成熟的影响、肝素对卵裂率和胚胎发育的影响、不同的培养体系对胚胎体外发育的影响(1)在成熟培养液中加入不同浓度的EGF后均能提高卵母细胞的成熟率,随着EGF浓度的增加,卵母细胞的成熟率也随之提高。添加30ng/mLEGF组的卵母细胞的成熟率为64.41%,与对照组之间差异不显著(P>0.05);添加50ng/mL与70ng/mLEGF组间的成熟率差异不显著(P>0.05),但均显著高于对照组与30ng/mLEGF组(P<0.05)。(2)不同浓度肝素处理受精液后,对卵裂率有显著影响,特别是当肝素浓度为5μg/mL时,卵裂率仅为53.93%,显著低于其他组(P<0.05)。其他三组卵裂率随肝素浓度增加依次升高,分别为67.22%,73.08%,76.50%,差异不显著;肝素浓度为80μg/mL时,囊胚率为22.22%,与其他三组差异显著(P<0.05),其他组囊胚率分别为33.33%,32.23%,35.96%。(3)分别用mSOF+颗粒细胞共培养体系和M199+颗粒细胞共培养体系培养卵母细胞,两种培养体系在卵裂率方面差异不显著(P>0.05),M199+颗粒细胞组囊胚率(2500%)与mSOF+颗粒细胞共培养组囊胚率(36.09%)间差异显著(P<0.05),说明本试验条件下mSOF+颗粒细胞共培养的培养体系更适合牛胚胎的体外发育。2.以LAMP方法为基础,对生产的体外胚胎进行性别鉴定本试验优化了环介导恒温扩增方法,以牛基因组为模板,设计了牛雄性特异性和牛特异性LAMP引物,并且优化了其反应条件,使LAMP在最佳的条件下进行扩增,快速鉴定基因组性别。同时本试验不再以琼脂糖凝胶电泳作为结果的检测手段,而是通过向LAMP反应后的PCR管中加入EB、CuSO4,从而形成颜色变化、沉淀的有无,直接通过裸眼进行鉴定,整个操作过程在1h左右完成。通过该方法对56个样品(牛胚胎)进行鉴定,敏感率和准确率达到100%(当取样细胞超过3个时)。本方法操作简便,准确率高,成本低廉,适合现场操作。
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