【摘 要】
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烟草坏死病毒A(TobacconecrosisvirusA，TNV-A)是单链RNA病毒，它的全基因组序列已被测出，含有6个开放表达阅读框。本研究利用套叠PCR的方法将克隆于pMD18-T载体上烟草坏死病毒A(T
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烟草坏死病毒A(TobacconecrosisvirusA，TNV-A)是单链RNA病毒，它的全基因组序列已被测出，含有6个开放表达阅读框。本研究利用套叠PCR的方法将克隆于pMD18-T载体上烟草坏死病毒A(TNV-A)基因的ORFⅣ与ORFⅤ(外壳蛋白)之间的非编码区形成突变SphI位点，构建了7个中间载体：pBSac-1、pMD18-TNV-1、pBSac-2、pMD18-TNV-S、pUCm-GFP、pUCm-LTB、pBluSKP-TNV-S。
将绿色荧光蛋白基因(GFP)、不耐热性肠毒素B亚单位(LTB)基因插入SphI突变位点，最后将突变后并连有GFP、LTB目的基因以及只含有突变的SphI酶切位点但未连有任何目的基因的TNV-A全基因插入植物表达载体pE1802的SalI/SmaI之间，构建成植物病毒载体pE-TNV-GFP、pE-TNV-LTB、pE-TNV。将这三种病毒载体转入农杆菌EHA105中，构建了农杆菌工程菌。
使用2ml没有针头的注射器将这三种农杆菌悬浮液压力渗透至心叶烟植株的叶片。每株注射约100μL的悬浮菌液，2周左右接种部位有可见枯斑，但未接种部位的叶片未见有枯斑。提取带有的枯斑心叶烟叶片总RNA，进行RT-PCR证实这三种病毒载体可以在心叶烟植株中局部表达。
利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，通过抗性筛选，获得三种生长状况良好的转基因烟草植株，进一步通过PCR、RT-PCR证实三种病毒基因已经在烟草中表达。
本研究利用实验室保存的农杆菌pBin-K88-ST/EHA105菌株，通过农杆菌介导法转化杂花苜蓿，通过抗性筛选，获得转基因苜蓿植株，经WesternDot检测，证明由目的基因K88-ST所编码的特异性蛋白在转基因烟草中分别获得了表达。
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