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旋毛虫病(Trichinellosis)是由旋毛虫(Trichinella spiralis)引起的一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病,是肉类食品安全性的一个重要指标。在旋毛虫的长期寄生生活中,分泌了大量具有免疫调节功能的蛋白,对宿主免疫系统进行调节,以逃避宿主免疫应答。这些分子除了其免疫调节功能外,还是潜在的疫苗候选分子,将它们应用于疫苗研究中将具有重要意义。泛素(Ubiquitin, Ub)是一个由76个氨基酸残基组成的小蛋白,普遍存在于真核细胞中且序列高度保守。泛素依赖性的蛋白质降解途径是目前已知的重要的、有高度选择性的蛋白降解途径之一。泛素化可对DNA疫苗的免疫应答产生影响。本研究克隆了2个具有免疫调节功能的旋毛虫分泌蛋白基因——旋毛虫巨噬细胞移动抑制因子(Tsmif)和旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子(Tsmcd-1),构建了pVAX1真核表达载体的DNA疫苗,在BALB/c小鼠体内对DNA免疫保护作用进行了研究。结果显示,Tsmif和Tsmcd-1的共表达能够诱导特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,并对旋毛虫感染产生部分的免疫保护。此外,与小鼠泛素的共表达增强了细胞免疫应答,并促进了pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫产生的抗感染保护能力。根据GenBank中发表的旋毛虫mif基因(Tsmif)序列(AY050661)和旋毛虫mcd-1基因(Tsmcd-1)序列(DQ777102),设计引物。以旋毛虫成虫总RNA为模板,RT-PCR扩增出大小2个TsMIF基因片段Tsmif和Tsmif",1个TsMCD-1基因片段Tsmcd-1.构建了3个重组质粒pVAX1-Tsmif、pVAX1-Tsmcd-1和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1;双酶切鉴定结果显示,阳性质粒分别切出3000bp的pVAX1.0质粒片段和大小相符的靶基因片段,即：345bp(Tsmif)、1221bp (Tsmcd-1)和1602bp (Tsmif-Tsmcd-1)。序列分析结果显示,扩增的Tsmif和Tsmif"基因片段与GenBank中已公布序列(AY050661)的核苷酸同源性和氨基酸同源性均为99.7%；扩增的Tsmcd-1基因片段与GenBank中已公布序列(DQ777102)的核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为100%。以pET28(b)为载体,构建原核表达重组质粒pET28(b)-Tsmif、pET28(b)-Tsmcd-1和pET28(b)-Tsmif-Tsmcd-1,分别在BL21大肠杆菌中表达。SDS-PAGE表明,重组蛋白rTsMIF表达于上清中,而重组蛋白rTsMCD-1与rTsMIF-TsMCD-1则主要以包涵体的形式存在。Western blot分析结果显示3种重组蛋白均能与感染旋毛虫的小鼠血清反应出现特异性条带(16.5kDa、50kDa和63kDa)。重组蛋白经纯化后,分别与弗氏佐剂乳化皮下注射免疫BALB/c小鼠,制备了以上3种重组蛋白的小鼠抗血清。为了检测TsMIF与TsMCD-1的特异性抗体,以重组蛋白rTsMIF-TsMCD-1作为抗原建立了间接ELISA(rTsMIF-TsMCD-1-E LISA);经方阵试验确定抗原包被浓度为2.3μml,血清检测稀释度为1：128,抗原与抗体的最佳反应时间为90min。为了研究Tsmif和Tssmcd-1的DNA疫苗免疫效果,将三种重组质粒pVAX1-Tsmif, pVAX1-Tsmcd-1和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1分别用肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠,以PBS和pVAX1分别为空白对照和空载体质粒对照；每组20只BALB/c小鼠,共免疫2次,间隔2周。二免后14d,进行攻虫保护试验。经口感染旋毛虫感染性幼虫(L1)35d后,剖杀所有小鼠分别计算肌肉荷虫量(LPG)。目的基因在小鼠体内的表达分别用RT-PCR和Western blot进行鉴定。结果显示,目的基因均在肌肉注射部位获得了表达,pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫产生了TsMIF和TsMCD-1的共表达蛋白。在首免后0、10、20、28d采集免疫小鼠血清,用重组蛋白rTsMIF-TsMCD-1包被的间接ELISA对免疫小鼠的特异性抗体水平的动态变化进行了分析,结果显示,pVAX1-Tsmif免疫没有产生特异性抗体应答；而pVAX1-Tsmcd-1和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫分别诱导了特异性IgG.IgM和IgA的产生,但没有检测到特异性IgE抗体。与pVAX1-Tsmcd-1相比,pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫引起了较低的抗体应答(P<0.05)。IgG亚型分析显示,IgG2a和IgG2b的抗体滴度显著高于IgG1,表现为Thl型抗体占优势的体液免疫应答。此外,对血清细胞因子含量的动态变化的分析结果显示,三种重组质粒的DNA免疫均产生了一定水平的Thl型细胞因子(IFN-γ),但未检测到Th2型细胞因子(IL-4、IL-5);低水平的TGF-β1可能与抑制优势细胞因子(IFN-γ)有关；各组均未能检测到IL-17,暗示没有炎症反应的发生。二免后14d,用流式细胞分析仪分析了免疫小鼠外周血淋巴细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量,结果显示,3个重组质粒免疫组的CD4+T细胞数量显著高于对照组(P<0.05),特别是pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫组(P<0.01);而pVAX1-Tsmif和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫组的CD8+T细胞的数量也显著高于对照组(P<0.05),pVAX1-Tsmcd-1免疫组则与对照无差异(P>0.05)；3个重组质粒免疫的CD4+/CD8+值均高于对照组,说明重组质粒免疫均促进了小鼠T淋巴细胞的增殖。攻虫保护试验结果显示,单独的pVAX1-Tsmif和pVAX1-Tsmcd-1免疫均未能获得LPG的减少,而pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫组的LPG则显著低于对照组(P<0.05),获得了23.17%的肌幼虫减虫率,表现出部分的免疫保护性。为了研究靶抗原泛素化对DNA免疫的影响,我们用RT-PCR克隆了小鼠泛素基因(Ub),并构建了与Ub共表达的重组质粒pVAX1-Ub-Tsmif、pVAX1-Ub-Tsmcd-1和pVAX1-Ub-Tsmif-Tsmcd-1。将以上重组质粒分别转染BHK细胞,Western blot没有检测到与重组蛋白TsMIF-TsMCD-1抗血清反应的目的条带,但加入蛋白酶体抑制因子MG-132后,分别检测到了大约22kDa、57kDa和68kDa的条带,其大小与预测的泛素化蛋白Ub-TsMIF、Ub-TsMCD-1和Ub-TsMIF-TsMCD-1的大小相符。体外转染试验结果显示,Ub共表达重组质粒转染BHK细胞后,表达了靶蛋白(TsMIF、TsMCD-1或TsMIF-TsMCD-1)的泛素化蛋白；泛素化促进了靶蛋白在BHK细胞内的降解,而MG-132可以抑制这种降解作用。随后,将Ub共表达重组质粒分别用肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠,以PBS和pVAX1、pVAX1-Ub分别为空白对照和空载体质粒对照、泛素免疫对照。通过检测特异性抗体应答、血清细胞因子水平和外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量,以及攻虫保护作用,对Ub共表达重组质粒的DNA免疫效果进行了分析。结果显示,靶抗原的泛素化下调了体液免疫应答,却促进了Thl型细胞因子的分泌,以及CD8+T细胞的增殖和免疫小鼠脾细胞的特异性CTL活性；重要的是,pVAX1-Ub-Tsmif-Tsmcd-1免疫组获得了更强的免疫保护性,表现为38%的肌幼虫减虫率。同时,这些结果也反映了Thl型细胞因子和CD8+T细胞免疫应答对旋毛虫抗感染的积极促进作用。