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目的:宫颈癌是妇女癌症的主要死因之一,其发生率仅次于乳腺癌,位居第二。目前宫颈癌的临床治疗以手术及放化疗为主,而传统中医药对改善宫颈癌患者术后损伤及放化疗毒副反应具有积极意义。丹参(Salvia Miltiorrhiza Bunge,SMB)制剂作为活血化瘀类中药已被应用于临床各领域,在心脑血管病、神经性疾病、肝炎及肝纤维化等的治疗中发挥重要作用,其抗瘤作用也已成为研究热点。但我们在预实验中发现,SMB注射液可促进宫颈癌Hela细胞生长增殖,提示丹参及其提取物作为传统中药,能否应用于宫颈癌患者及具此类肿瘤诱发体质人群其他疾病的治疗尚存在争议。本文通过体外实验探讨了SMB对宫颈癌Hela细胞生长增殖及其相关调控分子表达的影响,并从分子水平对其作用机制进行了初步探讨,为指导临床合理选用及慎用此种中药制剂奠定实验基础和提供理论依据。方法:确定最适宜的肿瘤细胞接种浓度及培养时间后,选用不同浓度的SMB作用于Hela细胞,以不经SMB作用的相应同步培养的Hela细胞作对照。MTT法测定SMB作用后对Hela细胞生长增殖变化的A492值。采用流式细胞计数法检测细胞周期及增殖凋亡状况,并计算出凋亡指数(AI)和增殖指数(PI)。培养细胞以HE染色进行常规病理观察;采用免疫细胞化学法测定Hela细胞中Bax、Bcl-2、PCNA等增殖凋亡相关分子表达的变化,分别以矩形走行计数200个细胞,计算表达阳性细胞百分率;并以图像分析系统进行定量分析,以灰度值(GS)表示阳性染色强度(取值范围为0~255,其数值越大表示阳性染色越弱,数值越小表示阳性染色越强)。结果:1 SMB对Hela细胞生长增殖的影响经MTT法确定实验用Hela细胞接种浓度为2×105/mL,培养时间为48h;与对照组(0.953±0.093)相比,200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL的SMB作用后可使Hela细胞生长增殖的A492值呈递进性显著增高(分别为1.957±0.102,1.853±0.087,1.743±0.107 1.616±0.102,1.776±0.185,均P<0.01);6.25mg/mL及3.125mg/mL的SMB作用后的A492无显著变化(分别为1.118±0.230,1.014±0.182,均P>0.05)。相关分析显示,A492值与浓度之间呈正相关(r =0.707, P=0.05)。2 SMB对Hela细胞周期及增殖凋亡的影响2.1对细胞周期的影响与对照组(79.47%±0.47%)相比,200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL的SMB可使Hela细胞G0/G1期的比例显著降低(分别为58.56%±2.43%,61.88%±2.38%,65.67%±1.25%,64.89%±2.45%,64.82%±3.24%,均P<0.05);6.25mg/mL及3.125mg/mL的SMB作用后G0/G1期的比例无显著变化(分别为72.94%±8.23%,76.31%±2.67%,均P>0.05)。与对照组(13.22%±1.89%)相比,200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL的SMB可使Hela细胞S期的比例显著升高(分别为23.80%±3.90%,P<0.01; 24.60%±3.60%,P<0.01; 20.98%±1.35%,P<0.01; 20.12%±1.12%,P<0.01; 19.04%±0.62%,P<0.05);6.25mg/mL及3.125mg/mL作用后S期的比例无显著变化(分别为17.92%±1.09%,P>0.05;16.59%±0.78%,P>0.05)。2.2对增殖凋亡的影响与对照组(5.85%±1.44%)相比,200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL的SMB可使Hela细胞的AI值显著降低(分别为1.20%±0.06%,P<0.01; 2.24%±0.72%,P<0.01; 2.82%±0.42%,P<0.01; 3.54%±0.60%,P<0.05);12.5mg/mL、6.25mg/mL及3.125mg/mL的SMB作用后AI值与对照组相比无显著变化(分别为4.45%±1.74%, P<0.01; 5.32%±0.87%, P<0.05; 5.74%±0.78%, P<0.05)。相关分析显示,AI值与浓度之间呈负相关(r =-0.892, P=0.003)。与对照组(13.13%±2.75%)相比,200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL的SMB可使Hela细胞的PI值明显增高(分别为31.86%±1.45%,P<0.01; 27.54%±1.08%,P<0.01; 18.73%±2.51%,P<0.05);25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL及3.125mg/mL的SMB作用后无显著变化(分别为16.13%±2.02%,16.36%±2.96%,15.77%±2.62%,13.69%±3.12%,均P>0.05)。相关分析显示,PI值与浓度之间呈正相关(r =0.969, P=0.000)。3 SMB对Hela细胞生长增殖相关调控分子表达的影响3.1对Bax蛋白表达的影响3.1.1 Bax的阳性表达率:与对照组(35.16%±2.75%)相比,200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL的SMB均可使Hela细胞中Bax的阳性表达率明显降低(分别为15.50%±1.50%, 19.66%±1.75%,24.66%±2.25%,21.50%±2.00%,28.16%±2.25%,均P<0.05);6.25mg/mL及3.125mg/mL作用后Hela细胞中Bax的阳性表达率无显著变化(分别为31.16%±2.25%,33.16%±2.50%,均P>0.05)。相关分析显示,阳性表达率与浓度之间呈负相关(r =-0.851, P=0.007)。3.1.2 Bax阳性表达的GS值:与对照组(85.07±15.31)相比,200mg/mL、100mg/mL的SMB可使Hela细胞Bax阳性表达的GS值明显增高(分别为140.95±8.51,136.45±32.33,均P<0.05);50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL及3.125mg/mL SMB作用后GS值无显著变化(分别为122.85±15.95,119.44±30.13,108.50±16.45,98.81±0.50,95.95±5.00,均P>0.05)。相关分析显示,GS值与浓度之间呈正相关(r =0.850, P=0.007)。3.2对Bcl-2蛋白表达的影响3.2.1 Bcl-2的阳性表达率:与对照组(77.96%±2.55%)相比,200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL的SMB可使Hela细胞中Bcl-2的阳性表达率明显增高(分别为95.83%±3.75%,94.00%±3.50%,88.50%±3.00%,91.16%±3.25%,均P <0.01);12.5mg/mL、6.25mg/mL及3.125mg/mL SMB作用后无显著变化(分别为85.16%±2.75%,80.50%±2.78%,82.36%±2.75%,均P>0.05)。相关分析显示,阳性表达率与浓度之间呈正相关(r =0.821, P=0.012)。3.2.2 Bcl-2阳性表达的GS值:与对照组(144.21±14.26)相比,200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL的SMB可使Hela细胞Bcl-2阳性表达的GS值明显降低(分别为105.18±1.20,109.08±3.78,113.15±8.54,112.81±12.04,均P<0.01);12.5mg/mL、6.25mg/mL及3.125mg/mL的SMB作用后GS值无差别(分别为129.84±6.03,127.59±2.63,144.59±9.45,均P>0.05)。相关分析显示,GS值与浓度之间呈负相关(r =-0.747, P=0.033)。3.3对PCNA蛋白表达的影响3.3.1 PCNA的阳性表达率:与对照组(41.00%±2.00%)相比,200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL的SMB可使Hela细胞PCNA的阳性表达率明显增高(分别为65.16%±3.75%,60.33%±3.75%,57.16%±3.75%,53.66%±3.25%,均P<0.01);12.5mg/mL、6.25mg/mL及3.125mg/mL的SMB作用后无显著变化(分别为45.33%±2.75%,43.00%±2.50%,47.33%±3.25%,均P>0.05)。相关分析显示,阳性表达率与浓度之间呈正相关(r =0.881, P=0.004)。3.3.2 PCNA阳性表达的GS值:与对照组(153.999±5.18)相比,200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL的SMB作用后Hela细胞PCNA阳性表达的GS值显著降低(分别为122.05±9.70, 133.76±6.34,134.22±7.76, 138.81±13.01,均P<0.05)。12.5mg/mL、6.25mg/mL及3.125mg/mL SMB作用后无显著变化(分别为146.50±4.48, 157.15±5.07, 157.31±4.52,均P>0.05)。相关分析显示,灰度值与浓度之间呈负相关(r =-0.877, P=0.004)。结论:1 SMB在一定浓度范围内可抑制Hela细胞凋亡,促进其生长增殖。2 SMB在一定浓度范围内可使Hela细胞出现S期阻滞,以促进细胞生长增殖。3 SMB在一定浓度范围内可使Hela细胞中Bcl-2、PCNA表达增强,Bax表达降低。4 SMB在临床抗肿瘤及其他疾病治疗应用中应慎重选择。