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研究背景与目的:肝癌是世界上最常发生的恶性肿瘤之一,其疗效差,复发率高,预后不良,原因可能与肿瘤中存在的一小部分具有自我更新和多向分化能力的肿瘤干细胞有关。mi RNAs是一类单链非编码RNA,其长约20-24个核苷酸,在转录后水平发挥调节基因的作用。近年来,已经证实mi RNA在肿瘤干细胞及肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用,它们可能作为肿瘤潜在的分子治疗靶点。在前期研究中,我们已经利用mi RNA芯片技术筛选出肝癌干样细胞与肝癌细胞中mi RNAs的差异表达谱。接下来我们旨在从mi RNAs的差异表达谱中找出与肝癌干样细胞相关的mi RNA,并研究其对肝癌细胞及肝癌干样细胞的影响及其作用机制,为肝癌的诊治提供新的方向。方法:第一部分:参与肝癌细胞向肝癌干样细胞转化过程mi RNA的筛选及验证1应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法在Huh7肝癌细胞及肝癌干样细胞中验证部分芯片结果。2应用RT-PCR方法在肝癌组织及癌旁肝组织中验证部分芯片结果。第二部分:mi R-27b-5p对肝癌细胞向肝癌干样细胞转化的肿瘤生物学功能研究1应用慢病毒感染技术构建mi R-27b-5p过表达的肝癌细胞。2应用CCK-8细胞增殖实验、划痕实验、克隆形成实验、Transwell细胞侵袭实验等实验方法和技术检测mi R-27b-5p在体外实验中对肝癌细胞生物学的影响。3应用单细胞成球实验、RT-PCR等实验方法和技术检测mi R-27b-5p在体外实验中对肝癌干样细胞干性的影响。第三部分:mi R-27b-5p促进肝癌细胞向肝癌干样细胞转化的机制研究1通过DIANA、MICRORNA、MIRDB、PICTAR、Target Miner、RNA22等生物信息学软件预测mi R-27b-5p调控的下游靶基因。2应用定量RT-PCR方法检测mi R-27b-5p与靶基因在m RNA水平上的相关性。3应用Western Blot方法检测mi R-27b-5p与靶基因在蛋白水平上的相关性。4应用双萤光素酶报告基因实验验证mi R-27b-5p对靶基因的直接调控作用。结果:第一部分:参与肝癌细胞向肝癌干样细胞转化过程mi RNA的筛选及验证1在前期研究中,通过mi RNA芯片技术初步获得肝癌干样细胞与肝癌细胞mi RNAs的差异表达谱,对芯片结果进行分析,肝癌干样细胞与肝癌细胞相比,差异十倍以上的mi RNA有35个,上调10个,下调25个,运用定量RT-PCR方法检测mi R-27b-5p在Huh7肝癌细胞及肝癌干样细胞中的表达与芯片结果一致。2运用定量RT-PCR方法检测mi R-27b-5p在肝癌组织及癌旁肝组织中的表达与芯片结果一致。第二部分:mi R-27b-5p对肝癌细胞向肝癌干样细胞转化的肿瘤生物学功能研究1 mi R-27b-5p过表达慢病毒感染Huh7肝癌细胞,感染72h后,mi R-27b-5p组和对照慢病毒(NC)组均出现明显绿色荧光蛋白表达,提示慢病毒感染成功。将感染后的肝癌细胞提取总RNA,进一步行定量RT-PCR检测,mi R-27b-5p组目的基因的表达明显高于NC组和空白对照(Blank)组,具有显著的统计学意义(P<0.01),表明过表达mi R-27b-5p成功。2通过慢病毒载体在肝癌细胞中过表达mi R-27b-5p成功后,进行一系列肿瘤细胞生物学行为检测:CCK-8细胞增殖实验发现过表达mi R-27b-5p可促进Huh7肝癌细胞的增殖(P<0.05);平板克隆实验发现过表达mi R-27b-5p可促进Huh7肝癌细胞的克隆形成(P<0.01);划痕实验发现过表达mi R-27b-5p可促进Huh7肝癌细胞的迁移(P<0.05);Transwell细胞侵袭实验发现过表达mi R-27b-5p可促进Huh7肝癌细胞的侵袭(P<0.01)。此外,对过表达mi R-27b-5p的肿瘤细胞在干性方面的变化进行检测:单细胞成球实验发现过表达mi R-27b-5p可促进肝癌干样细胞的自我更新(P<0.01)。定量RT-PCR实验发现过表达mi R-27b-5p可促进肝癌细胞干性基因的表达(P<0.01)。第三部分:mi R-27b-5p促进肝癌细胞向肝癌干样细胞转化的机制研究1通过DIANA、MICRORNA等生物信息学软件分析发现FOXO1可能是mi R-27b-5p的下游靶点。FOXO1已被证实是哺乳动物细胞中重要的抑癌基因。2定量RT-PCR结果显示过表达mi R-27b-5p肝癌细胞中的FOXO1m RNA表达水平相比于NC组和Blank组肝癌细胞明显降低,具有统计学差异(P<0.01)。3 Western Blot结果显示过表达mi R-27b-5p肝癌细胞的FOXO1蛋白表达水平相比于NC组和Blank组肝癌细胞明显降低,而NC组与Blank组之间无明显差异。4双萤光素酶报告基因实验结果显示相对于FOXO1-Mut组,mi R-27b-5p mimics的作用后,FOXO1-WT组的FOXO1-3’UTR质粒的表达趋势降低。结论:1 mi R-27b-5p不仅可促进肝癌细胞的增殖、侵袭与迁移,而且可促进肝癌干样细胞的自我更新与肝癌细胞干性基因的表达。2生物信息学软件预测FOXO1可能是mi R-27b-5p的下游靶点。3 mi R-27b-5p与FOXO1的表达具有显著相关性,且通过与FOXO1-3′UTR直接结合,抑制FOXO1的表达,从而发挥调控作用。