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大肠癌临床常见,全球每年有102万新发病例和53万死亡病例。在消化道肿瘤中发病率已仅次于胃癌,位居第二。大肠癌病因未明,近年的研究表明家族性乳腺癌相关基因BRCA1基因突变与大肠癌的相关危险度为1.4,BRCA2基因突变与大肠癌的相关危险度为4.4,大肠癌的发生似与FA/BRCA通路的异常相关。
范可尼贫血(Faneoni Anemia,FA)是一种具有肿瘤倾向的,少见的遗传性疾病,由调节DNA损伤的FA(或称FA-BRCA)通路蛋白的系列基因突变引起。FA-BRCA通路蛋白功能的错误表达导致DNA损伤修复的缺陷,特别是DNA交联的异常,最终导致染色体不稳定。FA-BRCA通路中的关键蛋白FANCD2的活化调控着FA-BRCA通路,95％的FA病人存在FANCD2功能异常。FA病人异常增高的肿瘤倾向证明了FANCD2的肿瘤抑制作用。目前FANCD2的功能未明,本研究旨在阐述FANCD2的复制后修复功能,了解其与HHR6和FA-BRCA通路问的关系,为研究FANCD2在大肠癌发病机制中的作用提供依据。
FA-BRCA通路作为肿瘤病因学的遗传模型日益受到重视。而FA-BRCA通路在人类非-FA肿瘤发生中的作用所知甚少。我们通过前期研究推测FA-BRCA通路的异常是由FA复合体蛋白之一FANCL的变异体FAVL触发,在我们检测的肿瘤细胞系中,半数以上的肿瘤细胞系FAVL表达明显增高,这很可能隐藏着人类肿瘤发生的重要的因为。我们是第一批探讨FA-BRCA肿瘤抑制通路,在人类非-FA肿瘤的发生发展中作用的研究者。
细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)是一组丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,目前发现有10种家族成员,有不同程度的同源性。细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase8,CDK8)定位于13q12,13,是CDK家族的一个成员,对细胞分裂周期的调节起着非常重要的作用,为细胞周期的正性调节因子。CDK8是其自身诱导的细胞转化及β-catenin调节基因表达所必须的,是一个真正的癌基因。BRCA1可以通过CDK抑制因子p21waft使细胞周期停滞于S期,通过调控有丝分裂中纺锤体组装,参与G2/M期检测点的调节,当DNA损失时,BRCA1作为一种负性调控因子参与细胞周期检测点的调节。BRCA1有多个磷酸化位点,其作用各不相同。G1/S期,BRCA1以锌指结构域作为主要作用域,通过转录因子E2F的作用和细胞周期蛋白CDKS作用物的磷酸化,抑制细胞进入增殖周期,阻止细胞分裂,诱发细胞凋亡。本研究中采用实时定量RT-PCR检测CDK8在大肠癌组织中的表达,并结合临床资料,探讨其与大肠癌发生发展的关系,为进一步研究CDK8与FA-BRCA肿瘤抑制通路关系及其在大肠癌分子发病机制中的作用提供依据。
本研究分三部分:
第一部分:FANCD2单泛素化是HHR6和FA-BRCA通路间的连接方式
第二部分:FA蛋白L的变异体FAVL促进人类非范可尼肿瘤的发生
第三部分:CDK8在大肠癌中的表达及其意义
第一部分:FANCD2单泛素化是HHR6和FA-BRCA通路间的连接方式
目的:
探讨FANCD2单泛素化与HHR6和FA-BRCA通路间的关系
方法:
采用MCF-7等细胞系用RNAi的方法下调HHR6,UBE2T和FANCL,用免疫印迹分析FANCD2单泛素化的变化情况；用细胞转染的方法上调HHR6,用免疫印迹分析FANCD2单泛素化的变化情况。用谷胱甘肽转移酶(glu-tathiones—transferase,GST)标记FANCL催化亚基,行GST-pulldown试验和蛋白质印迹,用抗UBE2T、HHR6或GST的抗体对其进行分析。采用RNAi的方法下调HHR6、UBE2T和FANCL,经过MMC处理,观察各组细胞存活率的变化。采用RNAi的方法下调HHR6,用免疫荧光、染色体核型分析等技术和共聚焦显微镜等设备,观察HHR6水平的减低对FANCD2聚集区的影响和DNA受损时染色体异常机率的变化情况。
结果:
结果显示调HHR6削弱FANCD2单泛素化,HHR6的两个亚型——HHR6A和HHR6B以类似的方式调节FANCD2单泛素化,HHR6过表达促进FANCD2单泛素化,HHR6与UBE2T以不同的方式调控FANCD2的单泛素化,HHR6通路和FA-BRCA通路对DNA交联剂MMC的反应相同,HHR6表达减低的细胞表现出FANCD2聚集区的减小和染色体异常的增加。
结论:
FANCD2单泛素化是HHR6和FA-BRCA通路间的连接方式。
第二部分:FA蛋白L的变异体FAVL促进人类非范可尼肿瘤的发生
目的:
探讨FANCL的异常连接体FAVL在人类非范可尼肿瘤发生中的作用
方法:
制备FAVL抗体；采用RNAi方法敲除FAVL,用抗FANCD2、FAVL和β-肌动蛋白的抗体对其进行蛋白质印迹分析；通过细胞质和细胞核FAVL的分析,确定FAVL的定位；用FAVL抗体对肿瘤组织病理切片进行免疫组化检测,了解不同肿瘤组织中FAVL的表达情况；用含有FAVL cDNA的质粒转染细胞,并对细胞进行新霉素筛选两周,MMC处理后进行蛋白质印迹分析单泛素化FANCD2、FAVL和β-肌动蛋白的蛋白水平；用过表达FAVL的U20S细胞注射至裸鼠皮下,观察不同FAVL水平的U20S细胞对异体移植肿瘤的形成的影响；用过表达FAVL的细胞进行MMC处理后,观察细胞的存活率。
结果:
FAVL是人类ESTBQ574618,FAVL在接近半数的己检测肿瘤细胞系和肿瘤组织标本中高表达。内源性和外源性的FAVL高表达都能损害FA-BRCA通路FA-BRCA通路的FAVL损伤是由减低的FANCL蛋白水平介导的,后者部分是由FAVL对FANCL在蛋白质水平上的调控引起的。FAVL可以收集胞质中的FANCL并促进FANCL的降解。高表达的FAVL导致FA复合物生成不足,后者对FA-BRCA通路的激活是至关重要的。FAVL增强灭活FA-BRCA通路,增加了染色体不稳定性,提供了一个重要的生长优势。在体内,由增强的FAVL触发的生长优势促进异种移植肿瘤的生长。
结论:
FA蛋白L的变异体FAVL促进人类非范可尼肿瘤的发生。
第三部分:CDK8在大肠癌中的表达及其意义
目的:
1.探讨细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)在大肠癌中的表达情况。
2.探讨CDK8表达情况与大肠癌患者临床病理资料的相关性。
方法:
1.采用SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR技术对50例大肠癌组织和相应正常大肠黏膜组织中的CDK8 mRNA的表达进行检测。
2.分析CDK8表达情况与大肠癌患者临床病理资料的相关性。
结果:
1.大肠癌组织中大肠癌组织中CDK8 mRNA的相对表达水平[1.1055(0.6262,1.7770)]显著高于相应的正常组织[0.5545(0.2910,1.0022)](P<0.05)。
2.有淋巴结转移的大肠癌组织中CDK8mRNA的相对表达水平[1.1695(0.8740,2.7317)]显著高于无淋巴结转移的大肠癌组织[0.8535(0.3542,1.7072)](P<0.05)。按肿瘤TNM分期对大肠癌组织进行分组,T3/T4期癌组织CDK8mRNA的表达水平[1.5915(0.9965,2.2892)]显著高于T1/T2期癌组织[0.5745(0.4005,0.9587)](P<0.05)。患者性别、年龄对CDKSmRNA表达水平的影响均无统计学意义(P值>0.05)。
结论:
CDK8与大肠癌有关,且表达水平可能成为判断大肠癌恶性潜能的指标。