论文部分内容阅读
背景内皮祖细胞(EPCs)的培养一般都是通过诱导原代单个核细胞分化获得,但其数量较少,不足以支持大规模实验。鉴于EPCs的分化培养实验技术难度较大,直到目前尚未建立商品化的细胞系。有效的提高内皮祖细胞的分化增殖是利用EPCs治疗股骨头坏死的关键问题。目的确立一种简便易行的内皮祖细胞培养方法,以满足进一步深入研究EPCs的生物学功能和实现以EPCs为基础的细胞治疗的需要,从而使以EPCs为基础的再生科学不再掣肘于方法学上的瓶颈。方法从人脐带血中采用ficoll梯度密度离心法分离单个核细胞,使用改良的Hill集落形成法培养内皮祖细胞。通过显微镜观察培养得到的细胞形态学的变化,通过免疫荧光检测EPCs摄取DiI-Ac-LDL及共结合FITC-UEA1的能力,使用流式细胞仪检测EPCs表面标志CD133/KDR和CD34/KDR的共表达情况,采用MTT法检测MNCs分化为EPCs后的增殖能力。结果采用改良的Hill集落形成法培养内皮祖细胞,在显微镜下可见典型的EPCs集落形成。免疫荧光结果显示99.7%的细胞具有双阳性,由此证实EPCs培养成功。流失结果显示：EPCs表面标志CD133/KDR和CD34/KDR的共表达率分别是52.30%±7.43%和54.77%±3.02%。MTT结果显示单个核细胞分化为内皮祖细胞后细胞呈稳定增长趋势。结论EPCs表面抗原表达较典型,符合早期EPCs的特定。采用改良的Hill集落形成法培养内皮祖细胞,可以得到足够数量的早期EPCs,有效地提高了EPCs分化增殖能力,可以为进一步深入研究EPCs的生物学行为提供有力的支持。背景成人股骨头缺血坏死(ANFH)的病因复杂,一旦发生股骨头缺血性坏死,股骨头局部血管的损伤和侧枝循环的难以形成必然导致预后较差。目前关于该病的发病机制还不完全清楚,普遍认为是由体内外源性多种环境因素所引起的,如激素和饮酒等,导致了该病现在的治疗方法也只是集中在如何处理其并发症上,缺乏从根本上逆转其病理进展变化的治疗方法。先前的临床观察实验已经确认EPCs在ANFH患者的功能及数量均减低。另外,研究发现在EPCs血管形成的过程中,CXCR4在EPCs向缺血或损伤区域靶向迁移的过程中起重要作用。近几年迅速发展的表观遗传学研究表明基因的表观遗传修饰是连接外界环境和基因相互作用的桥梁,因此对EPCs的CXCR4基因通过表观遗传调控机制进行相关研究,以此来解决使用EPCs治疗缺血性疾病的缺点,为从根本上逆转骨坏死病理变化的治疗方法的研究具有重要意义。目的通过CXCR4基因DNA去甲基化及组蛋白乙酰化提高EPCs表面CXCR4基因表达水平。采用相关方法检测上调的CXCR4对EPCs数量和功能的影响。为提高EPCs治疗的缺血性疾病的疗效,进而寻找从根本上逆转ANFH的有效方法。方法淋巴细胞梯度密度离心法从人脐带血分离单个核细胞,采用lOng/ml VEGF及lOng/ml FGF-basic诱导培养一周后得到内皮祖细胞(EPCs)并对其进行鉴定。单独或联合使用不同浓度梯度TSA和DAC对EPCs进行干预,并在细胞培养箱中避光48h。采用MTT检测EPCs的绝对数量和相对活性百分比,使用Western blot和实时定量PCR检测各组CXCR4蛋白和mRNA表达水平。甲基化特异性PCR检测CXCR4基因CpG岛甲基化状态改变。Transwell迁移实验检测EPCs迁移能力的变化。结果MTT结果显示EPCs的绝对数量程上升趋势,但是随着药物浓度增大和干预时间的延长其上升趋势变小,其活性百分比随着药物浓度增大和干预时间的延长而降低。Western blot和实时定量PCR结果显示干预后CXCR4表达水平随着随着药物浓度增大而升高。MSP结果表明CXCR4基因中CpG岛的甲基化状态在非干预状态下是甲基化的,在使用中高浓度药物干预时变为半甲基化或去甲基化。结论实验结果表明EPCs表面的CXCR4基因可以通过改变其表观遗传修饰状态来增加其表达水平,从而提高EPC在组织修复中的功能。EPCs的CXCR4基因的表观遗传干预可以作为逆转ANFH病理进展的一个新的思路。背景股骨头坏死(ANFH)是一种进展性疾病,病情难以逆转,患者多数结局是行全髋置换手术。研究发现EPCs具有可以向成骨方向分化,通过旁分泌作用增强缺血组织自我修复和形成血管的能力,有用于治疗ANFH的潜力。越来越多的研究表明与ANFH有着相似环境因素的心血管疾病中,表观遗传修饰在动脉狭窄和粥样硬化病情发展过程中起着极其重要的作用。以上研究结果提示可以尝试通过EPCs的表观遗传修饰来治疗ANFH。目的故本研究采用表观遗传修饰的办法提高EPCs细胞表面CXCR4表达,并将其应用在ANFH的动物模型上,以检测其治疗效果。方法50只新西兰大白兔适应性喂养4周后进行骨坏死造模,适应性喂养期间进行自体EPCs富集,冻存备用。骨坏死造模5周后进行MRI检测,造模成功的新西兰大白兔分为3组：对照组,EPCs治疗组,epigenetic-EPCs治疗组。分别用生理盐水,EPCs悬液,表观遗传修饰过的EPCs的悬液从耳缘静脉滴入。4周后进行显微CT和组织学切片检测,评价治疗效果结果50只新西兰大白兔最终有36只新西兰大白兔经MRI检测显示股骨头有异常信号改变,提示早期股骨头坏死。成模率72%。显微CT检查：CG组：股骨头软骨下骨小梁被破坏,数量减少,变薄；EEG组：少数股骨头软骨下骨小梁被破坏,破坏软骨下骨小梁数量较对照组少,但超过EG组。光镜组织学研究：CG组：孔陷窝较多,骨小梁变薄；EEG组：空陷窝数量较少,骨小梁变薄不明显；EG组介于两者之间。结论采用自体EPCs富集后输注的治疗策略,可以提高股骨头坏死区域自我修复的能力和血管形成能力,促进组织的再生修复,而经过表观遗传修饰过的EPCs更加有效。