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研究目的:胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在所有恶性肿瘤中居第五位,死亡率居第三位。东亚地区尤其是中国,胃癌的发病率最高。胃癌发病通常无特异性的早期症状,尽管有多种检查手段,但由于早期非侵入性检测技术的局限性,如CT、MRI、PET和血清学监测(CEA,CA19-9,CA125和CA72-4)敏感性低,而内窥镜检查普及率低,通常在转移发生后或处于晚期时才诊断为胃癌。即使在早期诊断并根治性的进行了手术切除,其局部出现复发和远处出现转移的机率仍然很高。尽管术后监测工具在不断的增多和进步,包括内窥镜监测(胃镜等),血清学监测(CEA,CA19-9,CA125和CA72-4),影像学检测(CT,MRI,PET等),但敏感性尚未达到预期。手术治疗,新辅助化疗,辅助化疗,放疗等治疗方式虽然延长了患者的生存期,但胃癌的异质性强,25%-40%的胃癌患者在治疗后会发生复发转移。治疗后出现复发和转移是胃癌治疗过程中的一大挑战。胃癌细胞的广泛侵袭和转移,特别是难以控制的远隔脏器的转移成为导致胃癌出现高复发率和高致死率的主要原因。近年来临床上为有效的消除肿瘤转移灶而采用了多种辅助治疗方法,但最终难以大幅提高晚期胃癌患者的缓解率和总体生存率。出现转移的胃癌患者预后很差,中位生存时间大约一年。癌细胞的侵袭、转移是由多个步骤组成的复杂过程。因此,深入研究胃癌发生侵袭、转移的分子机制,获得高敏感性和高特异性的肿瘤标志物和/或治疗靶点,对于及早发现、及早诊断并及早治疗胃癌的转移灶,进而提高晚期胃癌患者的生存期具有重要的理论和临床意义。酪蛋白激酶II(Casein kinase II,CSNK2)是一种多效丝氨酸/苏氨酸激酶,可磷酸化数百种底物并参与多种细胞过程,包括细胞周期调节,DNA复制和修复,发育和分化,转录,细胞信号传导,致癌作用和凋亡等。CSNK2具有形成稳定异四聚体的两个催化亚基(a)和两个调节亚基(β),是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,参与细胞生物学的各个方面,并且具有的靶标超过300个。CSNK2具有两种催化亚基,即CK2 α和CK2 α’,分别由CSNK2A1和CSNK2A2编码。CSNK2A1在恶性肿瘤细胞中的表达和激酶活性高于正 常对应细胞,并且已有证据表明CSNK2A1在乳腺癌,肺癌,肾癌,结直肠癌和前列腺癌中起着致癌作用。CSNK2A1的阳性表达在上述多种肿瘤中预示了较短的总生存期和无进展生存期。CD51(整联蛋白αv,integrin V)不仅是负责细胞与基质结合的跨膜糖蛋白,还是恶性肿瘤许多信号转导途径中的关键角色。研究证实,CD51在喉癌、下咽癌、前列腺癌、乳腺癌,肺癌,肾癌等恶性肿瘤中高表达,并与恶性生物学行为存在相关性。在结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)中,CD51过表达与晚期TNM分期存在相关性。研究显示CSNK2A1在非小细胞肺癌中,CD51在CRC中可通过转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)作用于上皮细胞-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)影响肿瘤细胞的迁移和侵袭。我们前期研究证实同一批胃癌标本上CSNK2A1和CD51的表达存在一致性。但是,CSNK2A1、CD51在胃癌中的表达情况如何?两者之间关系、表达情况与生物学行为及生存是否存在相关性,值得深入研究。基于上述原因,本课题检测了 CSNK2A1和CD51在胃癌组织标本中的表达情况;进而分析了其表达与临床病理特征及生存的关系;研究了其表达与侵袭、转移的相关性及作用机制。研究方法:第一部分:1.选取40例胃腺癌组织及其相对应的癌旁组织蜡块连续切取石蜡切片;选取250例的胃肿瘤石蜡组织(其中240例为胃腺癌,10例为胃胃肠间质瘤)制成组织芯片。2.免疫组化染色检测了 40例胃腺癌组织及其相对应的癌旁组织中CSNK2A1和CD51的表达情况;统计学分析CSNK2A1和CD51的表达在胃腺癌组织及相对应的癌旁组织之间的差异性;两者表达水平之间的相关性。3.免疫组化染色检测了组织芯片中CSNK2A1的表达情况。4.统计学分析CSNK2A1表达与性别、年龄、发病部位、分化程度、肿瘤大小、浸润深度(T分期)、淋巴结转移(N分期)、远处转移(M分期)、TNM分期、吸烟、饮酒等相关临床病理参数的关系。5.结合患者随访资料,分析CSNK2A1表达与患者生存的相关性;采用COX比例风险模型进行单因素和多因素分析患者总生存期,分析CSNK2A1表达是否是独立预后因素。第二部分:1.蛋白质印迹法(Western blot)和实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测 4 种胃癌细胞系(SGC790,SNU216,BGC823和HGC27)和1种正常胃上皮细胞系(GES-1)中CSNK2A1的表达情况。2.构建了过表达CSNK2A1的细胞系和敲低表达CSNK2A1的细胞系,同时构建相对应的阴性对照细胞系。4种细胞系平行进行后续实验研究。3.增殖实验:CCK8法研究胃癌细胞在CSNK2A1过表达和敲低表达后的第1,3,5,7天细胞生长曲线变化,以进一步研究CSNK2A1表达对胃癌细胞增殖能力的影响。4.克隆形成能力实验:平板克隆形成实验检测胃癌细胞CSNK2A1过表达和敲低表达后克隆形成能力的变化。5.迁移和侵袭实验:(1)划痕实验研究CSNK2A1表达对胃癌细胞迁移能力的影响。(2)细胞Transwell迁移、侵袭实验研究CSNK2A1的过表达及敲降对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响。第三部分:1.验证胃癌细胞中CSNK2A1表达与EMT的关系。(1)Western blot 实验检测 EMT 中相关转录因子 E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin在CSNK2A1的过表达及敲低表达的胃癌细胞系中的表达情况。(2)免疫荧光染色实验检测EMT中相关转录因子E-cadherin、N-cadherin在CSNK2A1的过表达及敲低表达的胃癌细胞系中的表达情况。2.探索性研究CSNK2A1通过PI3K-Akt-mTOR信号通路对胃癌细胞的侵袭转移的影响。(1)Western blot 检测 PI3K-Akt-mTOR 信号通路中 p-Akt S473、p-Akt t308、p-mTOR在CSNK2A1的过表达及敲低表达的胃癌细胞系中的表达情况。(2)Western blot检测使用PI3K抑制剂(ly294002)处理了的过表达CSNK2A1的 SNU216-Flag-CSNK2A1 细胞中 CSNK2A1、p-Akt S473/T308、p-mTOR 的表达情况。CCK8法检测其对增殖能力的影响程度。Transwell迁移、侵袭实验检测其对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响。研究结果:第一部分:1.CSNK2A1在胃腺癌组织中的高表达率为25%(10/40),在相对应的癌旁组织中为7.5%(3/40),差异有统计学意义(P=0.034)。结果表明CSNK2A1在胃腺癌组织中的表达水平高于相应的癌旁组织。CD51无论是染色强度还是阳性细胞占比在胃腺癌组织及其相对应的癌旁组织中均强表达,无法进行差异性比较。此结果最终显示CD51与CSNK2A1在胃腺癌中的表达无相关性。2.我们在大样本(组织芯片)中继续研究CSKN2A1的表达及其临床病理意义。CD51不再进行研究。在240例胃腺癌标本中,59例(24.58%)高表达CSNK2A1,181例(75.42%)低表达CSNK2A1。CSNK2A1在胃胃肠间质瘤中不表达(0/6)(其中4例在免疫组化过程中发生脱片)。3.CSNK2A1高表达与胃腺癌的分化程度、浸润深度(T分期)、淋巴结转移(N分期)和TNM分期显著相关,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。4.240例胃腺癌患者的术后1,3,5年总生存期(overall survival,OS)分别为82.50%,56.67%,39.17%。CSNK2A1低表达的胃腺癌术后患者比高表达的患者具有明显延长的生存期,差异有统计学意义(P=O.002)。5.单因素COX分析结果显示免疫反应评分(Immunoreactive score,IRS)、发病部位、分化程度、肿瘤大小、浸润深度(T分期)、淋巴结转移(N分期)、远处转移(M分期)、TNM分期是胃腺癌术后患者的不良预后因素(P<0.05)。多因素COX分析结果显示IRS(P=0.001)、浸润深度(T分期)(P<0.001)、淋巴结转移(N分期)(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)是独立不良预后因素。第二部分:1.Western blot和qRT-PCR实验结果:4个胃癌细胞系的CSNK2A1表达均高于胃上皮细胞细胞系(P<0.01)。CSNK2A1的表达在SGC790细胞中最高,在SNU216细胞中最低。2.选择低表达CSNK2A1的细胞系SNU216,构建了过表达CSNK2A1的细胞系SNU216-Flag-CSNK2A1;选择高表达CSNK2A1的细胞系SGC790,构建了敲低表达CSNK2A1的细胞系SGC790-KD-CSNK2A1,同时分别构建了阴性对照细胞系(SNU216-control 和 SGC790-control)。3.CCK8实验结果:SNU216-Flag-CSNK2A1在第1,3,5,7天时吸光度值(OD值)均明显高于 SNU216-control(P 值均<0.001)。SGC790-KD-CSNK2A1 在第 1,3,5,7天时OD值均明显低于SGC790-control(P值均<0.001)。以上的实验结果提示CSNK2A1的表达能够促进人胃癌细胞株的增殖。4.平板克隆形成实验结果:SNU216-Flag-CSNK2A1形成细胞克隆数较SNU216-control 明显增多(P<0.001)。SGC790-KD-CSNK2A1 形成细胞克隆数较SGC790-control明显减少(P<0.001)。以上的实验结果提示CSNK2A1的表达能够提高人胃癌细胞株的克隆形成能力。5.划痕实验结果:SNU216-Flag-CSNK2A1的迁移能力较SNU216-control升高(P<0.05)。SGC790-KD-CSNK2A1 的迁移能力较 SGC790-control 明显降低(P<0.01)。以上的实验结果提示CSNK2A1的表达能够提高胃癌细胞的迁移能力。6.细胞Transwell迁移、侵袭实验结果:SNU216-Flag-CSNK2A1的迁移、侵袭能力较SNU216-control明显升高(P<0.001)。SGC790-KD-CSNK2A1 组细胞的迁移、侵袭能力较SGC790-control组明显减弱(P<0.001)。以上的实验结果提示CSNK2A1的表达能够提高人胃癌细胞株的细胞迁移、侵袭能力。第三部分:1.Western blot 实验结果:SNU216-Flag-CSNK2A1 的 N-cadherin 和 Vinmentin表达较 SNU216-control 增高;E-cadherin 表达较 SNU216-control 减弱(P 值均<0.05)。SGC790-KD-CSNK2A1 的 N-cadherin 和 Vinmentin 表达较SGC790-control 减弱;E-cadherin 表达较 SGC790-control 增高(P 值均<0.05)。免疫荧光染色实验结果:SNU216-Flag-CSNK2A1的N-cadherin表达较SNU216-control增高;E-cadherin 表达较 SNU216-control 减弱。SGC790-KD-CSNK2A1 的 N-cadherin 表达较 SGC790-control减弱;E-cadherin表达较SGC790-control增高。以上的实验结果显示:在CSNK2A1过表达的调节下,EMT转化过程中的上皮细胞标志因子E-cadherin的减少,间质细胞标志因子N-cadherin和Vimentin的增多,标志着EMT的发生,在一定程度上预示着胃癌转移的开始。该部分研究验证了 EMT是CSNK2A1影响人胃癌细胞株的细胞迁移、侵袭能力的信号途径之一。2.Western blot实验结果:CSNK2A1过表达时,Akt和mTOR磷酸化水平升高,而当CSNK2A1敲低时,Akt和mTOR磷酸化水平降低。提示CSNK2A1可能通过PI3K-Akt-mTOR信号通路的激活,影响后续作用。ly294002降低了信号通路下游分子(p-Akt S473/T308,p-mTOR)的表达水平。Transwell迁移和侵袭实验表明,CSNK2AI增强了胃癌细胞的迁移和侵袭能力,但ly294002逆转了 CSNK2AI的这个效应。为了排除增殖对迁移和侵袭的可能影响,进行了 CCK-8实验,分析结果表明ly294002抑制了细胞增殖约1.5倍。这种减少不能解释ly294002抑制迁移和侵袭的巨大差异(大约低3到4倍)。这些发现表明CSNK2A1通过PI3K-Akt-mTOR途径促进胃癌的增殖,迁移和侵袭。研究结论:1.CSNK2A1在胃癌组织中高表达。CSNK2AI的高表达与分化程度、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分期存在相关性。CSNK2AI是胃癌术后患者的独立不良预后因素。CD51在胃癌中是无效指标。2.CSNK2A1的表达可以促进胃癌细胞的增殖、克隆形成,增强其迁移和侵袭能力。3.CSNK2A1通过EMT、PI3K-Akt-mTOR信号途径促进胃癌细胞的迁移和侵袭。