【摘 要】
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目的:本研究旨在评估在脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导所致的脓毒症急性肺损伤（Acute Lung Injury,ALI）时,嗜铬粒蛋白A（Chromogranin A,CGA）衍生多肽Chromofungin(CGA47-66,CHR)调控肺泡巨噬细胞自噬对肺组织及肺泡巨噬细胞功能的影响,并探讨可能机制。方法:在体内,通过对C57BL/6雄性小鼠行LPS（10 mg/k
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目的:本研究旨在评估在脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导所致的脓毒症急性肺损伤（Acute Lung Injury,ALI）时,嗜铬粒蛋白A（Chromogranin A,CGA）衍生多肽Chromofungin(CGA47-66,CHR)调控肺泡巨噬细胞自噬对肺组织及肺泡巨噬细胞功能的影响,并探讨可能机制。方法:在体内,通过对C57BL/6雄性小鼠行LPS（10 mg/kg）腹腔注射,建立脓毒症急性肺损伤模型,分别予以CHR及自噬诱导剂Rapa预处理30 min后,观察小鼠5天生存率及一般情况;LPS处理6 h后处死,提取小鼠肺组织,通过HE染色评估小鼠肺组织病理损伤;经支气管肺泡灌洗检测肺炎症因子水平;免疫荧光进一步观察各组肺组织中自噬相关蛋白的荧光强度表达情况,以期验证CHR对LPS诱导后对ALI的保护作用以及对肺组织自噬的影响;使用MH-S细胞,通过Western blot检测自噬相关蛋白与TLR4相关信号通路相关蛋白水平变化;透射电镜观察肺泡巨噬细胞自噬流改变,从而验证CHR通过TLR4相关信号通路对LPS刺激后肺泡巨噬细胞具有促进自噬的影响。结果:与对照组相比,LPS诱导的脓毒症模型小鼠6 h后进食减少,触之不动,出现腹泻且眼角分泌物增多,小鼠5天生存率为12.5%（P<0.05）;与LPS组相比,予以CHR和Rapa预处理后一般情况相对好转,CHR组小鼠5天生存率为68.75%（P<0.05）,Rapa预处理后小鼠5天生存率为81.25%（P<0.05）,均具有显著性差异。LPS组5天生存率较Control组明显降低。对肺组织进行组织病理学分析,通过苏木精-伊红染色（HE染色）切片后倒置显微镜下观察,与Control组相比,LPS刺激后观察到肺组织表现出间质水肿增厚、肺泡完整性破坏、大量炎性细胞浸润等急性炎症反应;同时与LPS组相比,CHR及Rapa组的病理学损伤明显减轻。免疫荧光检测小鼠肺组织中自噬标志物的荧光表达变化,结果显示与Control组相比,LPS组中自噬标志蛋白LC3B及Atg7荧光表达强度增强,P62的荧光强度没有表现出显著差异;予以CHR与Rapa预处理后LC3B及Atg7荧光强度较LPS组均有明显增强,同时P62荧光强度减弱。ELISA检测小鼠肺泡灌洗液中炎症相关细胞因子水平发现:与生理盐水对照组相比,LPS组中TNF-α（34.12±3.35 vs 4.19±0.13,P<0.05）浓度显著增加,同时IL-10表达降低（359.80±50.87 vs 1014±34.88,P<0.05）;与LPS组相比,CHR预处理后,TNF-α（20.37±2.17 vs 34.12±3.35,P<0.05）相对水平降低,IL-10水平升高（582.90±8.26 vs 359.80±50.87,P<0.05）,同时,Rapa组中炎症因子TNF-α（15.51±0.21 vs 34.12±3.35,P<0.05）水平降低,抗炎因子IL-10（923.20±46.29 vs 359.80±50.87,P<0.05）表达增加,差异均具有统计学意义。在小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S上,Western Blot检测结果,与Control组相比,LPS组LC3B蛋白水平明显降低,自噬底物蛋白P62表达水平增高;与LPS组相比,CHR组与Rapa组中LCB蛋白表达量均增加,P62蛋白表达则均显著减少。透射电镜结果显示Control组细胞形态完整,线粒体结构正常;CHR中存在自噬小体,自噬诱导剂Rapa组中自噬小体明显增多,CGA4-16组并无明显自噬体形成;LPS组细胞出现肿胀,细胞内含有板层小体,出现自噬小体正在形成的现象;CHR预处理后,均观察到自噬现象,观察到大量自噬溶酶体,且出现自噬溶酶体,相对于LPS组自噬现象明显,Rapa组作为自噬诱导剂预处理后,出现自噬溶酶体,自噬小体同样明显增多;CGA4-16组中未观察到自噬体形成。结论:CHR可通过调控TLR4相关信号通路促进肺泡巨噬细胞保护性自噬,对LPS刺激后ALI具有保护作用。
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