斜纹夜蛾视黄酸结合蛋白基因(Slcrabp)的克隆、表达及功能的初步研究

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视黄酸结合蛋白(Cellular retinoic acid binding protein,CRABP)属于胞内脂质结合蛋白超基因家族,广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中,参与了许多生理活动,如细胞分化,组织重建,信号转导等,在生物体的生长发育过程中起着非常重要的作用。我们从本实验室斜纹夜蛾(Spodoptera litura)中肠基因表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)文库中克隆得到了一个编码Slcrabp的全长cDNA,并且分析了它的基因结构,发育表达情况以及可能的生理功能。Slcrabp的cDNA由396个核苷酸组成,编码132个氨基酸组成的多肽,预测的分子量为14.8kDa,等电点(PI)为6.67。通过核苷酸序列比对分析发现,鳞翅目不同物种的CRABP基因相似性非常高,与烟草天蛾(Manduca sexta)的同源性可高达93.9%,同时该基因编码蛋白质的空间结构与脂肪酸结合蛋白的空间结构非常相似,只含一个结构域,由10个反平行的β折叠和2个α螺旋形成一个配体结合中心。利用cDNA和基因组DNA为模板,对Slcrabp基因结构进行分析,发现该基因可能没有内含子,与脊椎动物CRABP基因的结构可能不同。RT-PCR检测表明,在转录水平上,Slcrabp在6龄幼虫中肠的各个时期均有较高表达。Western blot结果显示,SlCRABP蛋白分布比较广泛,在中肠、脂肪体、精巢等组织上大量表达,并且在6龄的中肠组织中,表达量在预蛹期达到顶峰。利用荧光标记物质8-苯胺基-1-萘磺酸(1,8-ANS)分析了重组SlCRABP蛋白与不同底物的亲和力,发现SlCRABP与不饱和长链脂肪酸有较高的结合性,如花生四烯酸钠、亚麻酸、油酸钠和油酸,但是与视黄酸、视黄醇的结合力却很弱或者几乎不结合,预示着斜纹夜蛾中Slcrabp作为胞内脂质结合蛋白超基因家族成员之一,可能并未进化成可以真正结合视黄酸的基因,其功能与其家族的另外一个成员:脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein,FABP)相似,起到补充FABP功能的作用。为了进一步分析验证S/CRABP蛋白的生理功能,我们饥饿处理6龄幼虫,结果显示,经过饥饿处理24h、48h后,虫体内S/CRABP蛋白质的表达量有显著上升的趋势,说明饥饿会促进Slcrabp基因在蛋白水平的表达,这与SlCRABP蛋白和脂肪酸有较高的亲和力的结果相一致,与在不进食的预蛹期有较高蛋白表达的结果相符合,暗示着Slcrabp基因可能参与了昆虫体内脂类的转化或代谢过程。
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