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该文通过敏感度实验测定了G418和Cu<2+>作用于三株酿酒酵母工业菌株SK-1、SPSC-1、NAN-27的最低抑菌浓度,发现三株菌对G418的敏感性差别很大,G418作用于SPSC-1酒精酵母的最低抑菌浓度达到750μg/ml,对SK-1酿酒酵母的最低抑菌浓度只有100μg/ml.同株菌在不同的培养基上对铜离子的耐受性相差也很大,SPSC-1酒精酵母在YEPD培养基上可以耐受15mmol/L Cu<2+>,但在YNB基本培养基上只可以耐受1mmol/L Cu<2+>.对工业菌株酿酒酵母进行醋酸锂法转化的系列条件做了研究,确定OD<,600>值0.8-1.0时是最佳细胞收获时间,转化子先在完全培养基上生长6h再涂布G418选择平板可以大大提高转化子的数量.通过改进的原生质体转化法,使含铜抗性基因的质粒KB806成功转入工业酵母菌株SPSC-1和NAN-27中,初步解决了工业菌株转化难的问题.在真菌中,木糖转化为木酮糖的反应是在依赖NADPH的木糖还原酶(xylose reductase, XR)作用下,将木糖还原为木糖醇,然后在依赖NAD的木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase, XDH)作用下,转化木糖醇为木酮糖.接着木酮糖经木酮糖激酶(xylulokinase, XK)磷酸化形成5-磷酸木酮糖,这步酶促反应是木糖代谢的限速步骤之一.因此我们将来自毕赤氏酵母Pichia stipitis的木糖还原酶基因(XYL1)、木糖醇脱氢酶基因(XYL2)和酿酒酵母自身的木酮糖激酶基因(XKS1)连接到已构建的单拷贝整合载体pYIK和多拷贝整合载体pYMIK上.PGK和ADH1启动子均为酿酒酵母组成型强启动子,而PGK启动子的表达效力比ADH1启动子强.将XYL1基因置于乙醇脱氢酶启动子ADH1控制下,将XYL2基因置于磷酸甘油激酶启动子PGK控制下,从而控制木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的表达量,减少因木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的辅酶不能相偶联,细胞内氧化还原失衡所致的木糖发酵中的木糖醇积累.XKS1基因置于磷酸甘油激酶启动子PGK控制下.得到重组质粒pYIK-123和pYMIK-127.将所构建酿酒酵母重组菌在氧气限量的条件下,进行木糖葡萄糖共发酵实验.重组菌的生长情况和宿主菌没有明显区别,表明外源基因的引入对重组菌的生长没有影响.发酵产物进行HPLC分析,结果表明各重组菌都能利用木糖产生乙醇.其中,以酿酒酵母工业菌株为宿主菌,多拷贝整合木糖还原酶(XR)基因、木糖醇脱氢酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)基因的酿酒酵母重组菌NAN-127利用木糖生产乙醇的效果最优.对木糖的利用最高可达18.4g/L,较宿主菌提高了2倍,乙醇产量最高可达7.9g/L,较宿主菌提高39﹪.由此在酿酒酵母实验室菌株和工业菌株中分别建立了细菌和真菌的两条木糖代谢途径.经过比较,发现由rDNA介导的多拷贝整合木糖代谢酶基因的重组菌对木糖的利用和乙醇的产生都高于单拷贝整合木糖代谢酶基因的重组菌.并且以酿酒酵母工业菌株为宿主菌的重组菌对木糖的利用和乙醇的产生高于以实验室菌株为宿主菌的重组菌,乙醇的产生速度也较实验室酿酒酵母重组菌快,表明不同遗传背景的宿主菌对构建利用木糖生产乙醇的工程菌有重要的影响.