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研究目的:嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T,CAR-T）治疗最常见并发症CRS的临床治疗需要既能保持CAR-T体内有效性又能提高安全性的药物。本文旨在筛选对CAR-T杀伤效率不影响的药物,并系统考察其中一种药物雷帕霉素对CAR-T细胞体外特异性杀伤效率、CAR-T细胞的扩增能力以及CAR-T细胞活化中细胞因子分泌的影响,为进一步开展雷帕霉素治疗CAR-T相关细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome,CRS）的研究提供基础理论依据。研究方法:第一部分CAR-T细胞的制备及药物筛选1.采用Ficoll密度梯度离心法从脐带静脉血中分离获得人脐带血单个核细胞（cord blood mononuclear cells,CBMC）。2.采用CD4+、CD8+磁珠从CBMC中分选纯化获得T细胞。3.将制备的CD19.CAR慢病毒转导T细胞,用流式细胞术检测慢病毒转导效率,获得CD19.CAR-T细胞。4.以CD8+CD19.CAR-T细胞作为效应细胞,EGFP标记的CD19+Nalm-6细胞作为靶细胞,按照设置的效靶比在37℃、5%CO2培养箱中进行混合培养,建立体外特异性杀伤模型。将选取的药物置于杀伤模型中,通过流式细胞术检测CAR-T细胞的杀伤效率。第二部分探索雷帕霉素对CAR-T细胞功能的影响1.以CD19.CAR-T细胞中的CD8+CD19.CAR-T细胞为效应细胞,CD19+Raji细胞为靶细胞,按照设置的效靶比在37℃、5%CO2培养箱中混合培养,建立体外特异性杀伤模型。在此杀伤模型基础上,考察了不同因素对CAR-T杀伤能力的影响,包括不同浓度的雷帕霉素、在不同效靶比中加入雷帕霉素以及在不同时相点加入雷帕霉素。于共培养的第18h、72h取每孔细胞悬液,采用流式细胞术检测各孔中剩余靶细胞数量,计算CAR-T细胞18h、72h的杀伤率。2.在特异性杀伤模型基础上,考察了不同因素对杀伤后CAR-T细胞数量变化的影响,包括雷帕霉素不同浓度、雷帕霉素加入的不同时相点。于共培养的第72h（3天）、144h（6天）取每孔细胞悬液,采用流式细胞术分别检测各孔中剩余CAR-T细胞数量。3.将羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记的CAR-T细胞在不同浓度雷帕霉素条件下与Raji细胞共培养,于共培养的第72h,流式检测带CFSE荧光的CAR-T细胞数,反应CAR-T细胞的扩增能力。4.CAR-T细胞在不同浓度雷帕霉素条件下与Raji细胞共培养,于共培养的第18h取细胞悬液,PI+Annivx双染CAR-T细胞,流式检测CAR-T细胞的早期凋亡率与晚期凋亡率。5.CAR-T细胞在不同浓度雷帕霉素条件下与Raji细胞共培养,于18h取培养上清液,采用流式细胞术微球阵列法（CBA）检测上清液中细胞因子含量。6.CAR-T细胞在不同浓度雷帕霉素条件下与Raji细胞共培养,于18h取细胞悬液,采用流式胞内荧光抗体染色法检测CAR-T细胞胞内细胞因子表达水平。研究结果:第一部分CAR-T细胞的制备及药物筛选1.采用Ficoll梯度离心法获得人CBMC;2.通过免疫磁珠法获得纯度超90%的T细胞;3.通过慢病毒转导法获得CAR阳性率超90%的CAR-T细胞;4.所筛选药物中的大部分均会抑制CAR-T细胞的体外杀伤效率,其中不影响CAR-T细胞的体外杀伤效率的仅有地塞米松、泽布替尼、雷帕霉素。第二部分雷帕霉素对CAR-T细胞功能的影响1.在不同浓度雷帕霉素以及不同效靶比、不同时相点加入雷帕霉素等因素下,CAR-T细胞第18h各组间杀伤率无统计学差异,第72h各组间杀伤率无统计学差异。2.在不同浓度雷帕霉素、不同识相点加入雷帕霉素等因素下,雷帕霉素组CAR-T细胞杀伤过程中数量的增加明显低于无雷帕霉素组。3.雷帕霉素组CAR-T细胞的CFSE荧光强度降低程度较无雷帕霉素组CAR-T细胞的低。5.雷帕霉素组CAR-T细胞第18h凋亡率与无雷帕霉素组的凋亡率无统计学差异。6.雷帕霉素组第18h上清液中的细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、s CD25、VEGF、CCL4、Granulysin、Granzyme A、Granzyme B水平较无雷帕霉素组的低,部分细胞因子降低比例在50%及以上。7.雷帕霉素组第18h实验孔中CAR-T细胞胞内细胞因子IFN-γ、GM-CSF以及IL-2的表达量低于无雷帕霉素组。研究结论:本研究采用新生儿脐带静脉血为来源,通过Ficoll密度梯度离心法以及免疫磁珠法纯化获得T细胞,通过慢病毒转导法成功制备CAR表达率超90%的CAR-T细胞。通过对部分临床常见药物进行筛选发现雷帕霉素不影响CAR-T细胞体外杀伤靶细胞的效率。进而,在体外利用靶向CD19的CAR-T细胞与CD19+CD22+Raji靶细胞的T细胞特异性杀伤模型,在不同效靶比、不同时相点、不同雷帕霉素浓度下,通过流式细胞绝对计数检测细胞杀伤率,证实雷帕霉素不影响CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力。通过羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测CAR-T细胞扩增能力,发现雷帕霉素通过抑制CAR-T细胞增殖而非促进凋亡的方式降低其活化后的扩增数量。通过流式细胞术微球阵列法（CBA）检测细胞因子分泌情况,发现雷帕霉素可显著性降低CAR-T细胞被靶细胞活化后的细胞因子分泌水平。以上表明雷帕霉素可在不影响CAR-T细胞杀伤功能的前提下,降低其炎性因子分泌水平。本研究结果提示雷帕霉素可能是用于预防或治疗CAR-T常见并发症细胞CRS的潜在药物。