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目的:急性肺损伤(acute lung iniury,ALI)是由多种原因引起的,以肺泡-毛细血管膜和肺上皮广泛受损所致的肺水肿和肺不张为主要特征,临床上可表现为呼吸窘迫和顽固性低氧血症,进一步发展即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。多种病因(包括肺内/肺外,感染/非感染)都能直接或间接地引起.ALI及ARDS。革兰氏阴性细菌内毒素的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是导致肺部感染和全身感染的主要因素。LPS由其受体介导启动机体炎症反应,进而导致全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory responsesyndrome,SIRS),在肺部可表现为ALI,中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophil,PMN)在肺内大量扣押、激活及释放大量炎症介质及活性氧物质等,导致弥漫性肺组织损伤,是其发病学的中心环节。然而对于LPS启动机体炎症反应、导致ALI的具体机制尚未完全阐明。
祖国医学认为“肺与大肠相表里”,严重肺损伤后气滞血瘀,肺气郁闭,宣降失常,扰乱了肺与大肠相表里的原理。大承气汤(Dachengqidecoction,DD)是主治阳明腑实证的名方,首载于《伤寒杂病论》,由大黄、芒硝、枳实、厚朴四味药组成,具有攻下实热、消除痞满之功。有研究证实DD能同时改善胃肠、肺等多脏器的血液循环,降低毛细血管的通透性,使肺水肿及内环境紊乱得到改善,提高肺的通换气功能,促进肺损伤的修复。我室也曾证实DD可通过抗氧化、抑制炎症因子的释放等改善内毒素休克及LPS所致ALI时肺的病理改变,但其具体机制尚未完全阐明。有研究发现DD具有清除自由基,增强机体抗氧化能力,且能调节和改善机体自由基代谢的平衡,此可能是其通腑利肺的作用机制之一。
近年来血红素加氧酶(heme oxygenase-1,HO)在组织氧化应激损伤中的作用受到人们的关注。HO是血红素代谢的起始限速酶,分解血红素为胆绿素、一氧化碳(carbon monoxide,CO)及铁,胆绿素在胆绿素还原酶的作用下进一步生成胆红素,HO-1为其诱导型,也称热休克蛋白32。多项研究认为HO-1是细胞的一种内源性保护蛋白,其本身及分解产物均具有强大的抗氧化功能。
既然HO-1是一种内源性的强抗氧化剂,具有抗氧化、抗脂质过氧化、保护细胞免受伤害的作用;而DD也具有清除自由基,增强机体抗氧化能力的作用。是否DD可通过激活HO-1/CO体系从而发挥治疗ALI的作用呢?目前国内外尚未见报道。DD在机体抗氧化、抗炎防御体系中的地位和机制到目前仍不清楚,所以从分子水平去解决上述问题,可为DD的广泛应用开辟更为广阔的前景。本课题通过气管内滴注LPS复制小鼠川模型,旨在在体实验探讨HO-1/CO体系在DD改善LPS引起的小鼠ALI中的作用,为DD的临床应用及ALI的临床防治提供一定的理论和实验依据。
方法:将110只雄性昆明小鼠随机分为7大组,11小组(每小组10只):①Control组:经气管滴注无热源生理盐水(NS)(50μl·只-1);②LPS组:经气管滴注LPS(200μg/1000μl,50μl·只-1);③DD预防组(DD preventiongroup,DD pre.):按应用DD剂量分200μlDD预防组与400μlDD预防组,给予DD(大黄12g,厚朴24g,枳实12g,芒硝6g,先煮枳实、厚朴,煮沸15min,再下大黄煮沸5min,最后冲芒硝浓缩成40ml药液)200μl·只-1、DD400μl·只-1灌胃,30min后气管内滴注LPS;④DD治疗组(DD treatment group,DDtreat.):按应用DD剂量分200μlDD治疗组与400μlDD治疗组,气管内滴注LPS,30min后给予DD200μl·只-1、DD400μl·只-1灌胃;⑤LPS+Hm(氯血红素,CO供体)组:气管内滴注LPS前10min经尾静脉注入Hm(10mg/kg,10g/L);⑥LPS+ZnPP(锌原卟啉,HO-1特异性阻断剂)组:气管内滴注LPS前10min经尾静脉注入ZnPP(10mg/kg,10g/L);⑦LPS+ZnPP+400μlDD组:气管内滴注LPS前10min尾静脉注入ZnPP(10mg/kg,10g/L)其后40min给予400μlDD灌胃。LPS组小鼠于气管内滴注LPS后2h、6h和10h,其余各组于术后10h,眼球取血后处死动物留取肺组织标本,血液静置10min后离心留取血清。采用生化方法检测血清中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性;光镜下观察肺组织形态学变化;采用免疫组织化学染色和Western blot方法检测肺组织中HO-1蛋白表达的变化。
数据均以均数±标准差((x)±s)来表示,组间差异用单因素方差分析(one-way ANOVA),有显著差异者用SNK-q检验进行两两比较,均以P＜0.05为有统计学意义。
结果:1血清中MDA含量的变化:与Control组小鼠血清MDA含量(4.75±0.12 nmol/L)相比,LPS组小鼠经气管内滴注LPS后不同时间点血清MDA含量(2h(8.38±0.38 nmol/ml,P＜0.05)、6h(14.23±0.75nmol/ml,P＜0.01)、10h(20.75±1.23 nmol/ml,P＜0.01))均显著升高,相邻各时间点相比具有时间依赖性(P均＜0.01);与10h LPS组相比,DD预防组血清MDA含量(200μlDD(14.26±0.78 nmol/ml)、400μlDD(12.78±1.26 nmol/ml),P均＜0.01)均明显降低,且具有剂量依赖性(P＜0.01);与400μlDD预防组血清MDA含量相比,各DD治疗组血清MDA含量(200μlDD(10.08±0.89 nmol/ml,P＜0.05)、400μlDD(8.24±0.22 nmol/ml,P＜0.01))均明显降低,且具有剂量依赖性(P＜0.01);但400μlDD治疗组与Control组血清MDA相比仍有差异(P＜0.01);与10h LPS组血清MDA含量相比,LPS+Hm组血清MDA含量(5.21±0.09 nmol/ml,P＜0.01)降低而LPS+ZnPP组血清中MDA含量(24.25±1.38 nmol/ml,P＜0.01))升高;与40μlDD治疗组血清MDA含量相比,LPS+ZnPP+40μlDD组血清MDA含量(17.02±1.27 nmol/ml,P＜0.01)明显升高。
2血清中SOD活性的变化:与Control组小鼠血清SOD活性(168.37±4.57 U/m1)相比,LPS组小鼠经气管内滴注LPS后不同时间点SOD活性[2h(132.78±3.21 U/ml]、6h(99.26±4.23 U/ml)、10h(75.86±2.74U/ml),P均＜0.01)均显著降低,相邻各时间点相比具有时间依赖性(P均＜0.01);与10h LPS组血清SOD活性相比,DD预防组血清SOD活性(200μlDD(88.23±1.67 U/ml,P＜0.05)、400μlDD(111.96±2.35U/ml,P＜0.01))均明显升高,且具有剂量依赖性(P＜0.01);与400μlDD预防组血清SOD活性相比,各DD治疗组血清SOD活性(200μlDD(128.03±3.24 U/ml)、400μlDD(147.65±4.19 U/ml),P均＜0.01)均明显升高,且具有剂量依赖性(P＜0.01);但400μlDD治疗组与Control组血清SOD活性相比仍较低(P＜0.05);与10h LPS组血清SOD活性相比,LPS+Hm组血清SOD活性(97.52±3.78 U/ml,P＜0.01)升高而LPS+ZnPP组血清SOD活性(56.09±2.53 U/ml,P＜0.01)降低;与400μlDD治疗组血清SOD活性相比,LPS+ZnPP+400μlDD组血清SOD活性(85.02±3.23 U/ml,P＜0.01)明显降低。
3肺组织病理形态学观察:Control组肺泡结构清晰,壁薄,肺泡腔内无渗出液;滴注LPS后2h肺泡间隔明显增厚,肺泡萎陷及炎细胞浸润,6h时其结构已无法辨认,10h时损伤更加显著;与10h LPS组相比,各DD干预组肺组织损伤程度均明显减轻,且治疗组好于预防组,高剂量组好于低剂量组。各DD干预组肺泡结构仍然存在,肺泡间隔略增厚,PMN浸润较LPS组明显减轻,肺泡腔内渗出不明显,但个别区域仍存在炎症改变;与10h LPS组相比,LPS+Hm组肺组织损伤较减轻而LPS+ZnPP组肺组织损伤加重,后者肺泡组织结构无法辨认,肺内大量炎细胞浸润;LPS+ZnPP+400μlDD组肺组织损伤较400μlDD治疗组加重,肺内有大量炎细胞浸润。
结论:1 DD可以改善LPS诱导的ALI,其保护作用表现在抗氧化性损伤,改善肺微血管通透性、减少肺间质及肺泡内渗出等方面。
2 DD的抗氧化作用与其可上调HO-1蛋白表达有关。