论文部分内容阅读
微生物在当今被普遍认为是一些生物活性物质和新化合物的高效生产者。而生存于极地的微生物由于气候极其苛刻、恶劣,这就意味着来自于极地微生物的生物活性物质对于人类可能具有特殊的意义。极地微生物(海冰微藻和细菌)分泌产生大量的胞外多糖(EPS),这些物质聚集在冰藻和细菌生存的海冰通道中,提供了海冰和冰水界面的有机碳,是能源传输的主要物质。南极洲上的动植物种类也较少,但它却蕴含着极为丰富的微生物资源,它是一座重要的微生物资源宝库。其中包括大量的嗜冷和适冷微生物,这些微生物可以产生许多新型活性物质和先导化合物,如多糖、蛋白质、酶、抗生素和脂类等。这些活性物质将为以后的基础研究和开发应用等方面提供巨大的帮助。糖类(单糖、寡糖、多糖等)是人类赖以生存的能量来源,又是很多动植物及微生物的重要组成物质。寡糖因其分子结构和聚合度大小的不同而具有不同的生理活性,其在分子生物学、食品学、医药卫生学等许多领域都有广阔的发展前景和市场价值。本文以中国第24次南极科学考察乌拉圭站采集的海冰样品中的Psychrobacter sp.B-3嗜冷杆菌为出发菌株,通过对其发酵培养及分离纯化获得分子量为1000Da胞外低聚糖纯品,随后又对该胞外低聚糖的结构组成及抗氧化活性进行了研究,并利用响应面优化法对该菌株的发酵产糖条件进行了优化,取得了如下的成果和结论：南极菌Psychrobacter sp.B-3胞外低聚糖的分离纯化：采用2216E液体发酵培养基对南极嗜冷菌B-3进行发酵培养,离心取发酵上清液,加入三倍体积的95%的乙醇进行过夜醇沉,离心取沉淀,复溶后用Seveage法除蛋白,再醇沉后进行冷冻干燥获得胞外粗糖制品；再采用Sephadex G-75凝胶层析柱对该胞外粗糖样品进行分离纯化,经检测有两个峰,取Ⅰ号峰糖样冻干后进行Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析,之前的峰Ⅱ收集备用,对经过离子交换层析分离得到样品进行检测收集；将经过两次层析分离得到的样品进行高效液相色谱(HPLC)及高效渗透凝胶色谱(HP-GPC)检测,测得样品分子量为1000Da,纯度较高符合进行下一步实验的要求,命名为EPS-1,又对样品做了蛋白质及淀粉检验结果为阴性,均不含其它杂质。南极菌Psychrobacter sp.B-3胞外低聚糖的结构分析：通过气相色谱(GC)分析结果表明,南极嗜冷菌B-3胞外寡糖样品ESP-1由葡萄糖,甘露糖组成,又经过进一步的核磁共振分析,得出该胞外低聚糖EPS-1的结构为：一(β-Ⅰ]-Man-β-D-Man-α-D-Glu)2-。南极菌Psychrobacter sp.B-3发酵产糖的响应面法优化：以温度、pH、不同碳源、氮源、金属离子及海水配比作为唯一变量进行单因素实验,筛选出对产糖有显著影响的单因素取值范围；在此基础上，利用lackett-Burman实验设计筛选出影响产多糖的3个主要因素,即酵母粉、陈海水配比和装液量。然后通过Box-Behnken实验设计及响应而分析法进行回归分析,得出了南极菌Psychrobacter sp.B-3发酵条件系统优化的结果为：酵母粉1.1g/L,陈海水与自来水的配比为2：1,装液量为50%,蛋白胨6.0g/L,接种量1.5%,培养时间64h,BaCl z0.03g/L,温度10℃,转速150r/min,pH为7.0.优化后发酵液中的糖含量由优化前的444μg/ml提高到624μg/ml,相比初始糖产量提高了近1.4倍。结果表明,响应面法可显著优化南极菌Psychrobacter xp.B-3液体发酵产胞外糖的条件。南极菌Psychrobacter sp.B-3胞外低聚糖的抗氧化活性研究：采用羟自由基的清除能力、DPPH自由基的清除能力、超氧阴离子的清除能力及抗脂质过氧化能力实验对南极嗜冷菌B-3的胞外寡糖样品抗氧化能力进行分析,结果表明,经过两次分离纯化的样品EPS-1的抗氧化能力最强,总糖EPS-3的抗氧化能力次之,峰Ⅱ部分样品EPS-2抗氧化活性最小,其中总糖EPS-3只经过除蛋白,未经过层析分离。糖的活性与其结构因素有关,如多糖的取代基,糖单元的类型和糖苷键的构型等,这些因素导致了不同的糖具有不同的活性。本文首次对南极嗜冷菌B-3胞外寡糖的抗氧化活性进行研究,并分析了该寡糖样品的结构,为我国的“海洋糖库”提供了一种结构新颖的特征寡糖。实验又通过响应面优化为该菌种找到了最佳发酵产糖条件,为南极微生物代谢产物的开发应用打下了一定的理论基础。