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巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Mull.Arg.)是天然橡胶的主要来源。人们为了收获胶乳,每隔2到3天割胶一次,使得橡胶树成为世界上受机械伤害最频繁的植物之一。产排胶是巴西橡胶树的创伤反应,而茉莉酸是调控植物创伤反应的主要激素,也是控制橡胶树乳管分化和胶乳合成的关键信号分子。但巴西橡胶树的茉莉酸信号途径尚未被鉴定,并且茉莉酸信号调控橡胶乳管分化及胶乳生物合成的分子机理至今未被阐明,使橡胶基础研究及生产技术提升陷入理论瓶颈。为了研究茉莉酸如何调控橡胶创伤反应及产排胶,本文对巴西橡胶树茉莉酸信号相关基因进行了克隆及功能鉴定,取得以下研究结果:(1)首先采用生物信息学的方法全基因组筛选具有JAZ结构特征的橡胶cDNA序列,再采用电子克隆技术将不同长度的cDNA片段进行拼接,获得12个橡胶JAZs基因的全长cDNA序列,通过设计特异性引物并经PCR扩增其全长阅读框,其中7个被成功克隆,根据其序列结构特点,分别被命名为HbjAZ1、HbjAZ2、HbjAZ7、HbJAZ8、HbjAZ9、HbjAZ10郝HbjAZ11。(2)荧光定量PCR分析显示,所有HbjAZs基因在树叶中的表达量均高于胶乳和树皮。HbjAZ1,HbJAZ7和HbJAZ11在橡胶树叶中表达量非常高,并且HbJAZ1在胶乳和树皮中表达也相对较高。酵母双杂鉴定发现,除HbJAZ2外,所有HbJAZs蛋白均能与自身发生互作,形成同源二聚体;大部分HbJAZs蛋白能与其他HbJAZs蛋白发生互作,形成异源二聚体。(3)通过电子克隆,获得了 3个与HbJAZ1蛋白互作的MYCs转录因子(分别被命名为HbMYC2、HbMYC3和HbMYC4)和一个锌指蛋白的全长cDNA序列。利用酵母分析系统发现HbMYC2、HbMYC3、HbMYC4和锌指蛋白的转录自激活活性非常强。GFP亚细胞定位证明,HbMYC2、HbMYC3和HbMYC4位于细胞核,说明它们具有转录因子的基本特征。(4)本文对23个不同来源的bHLH蛋白进行序列比对和系统进化树分析,发现所有能与JAZs蛋白互作并受茉莉酸调控的bHLH转录因子都聚类在一起,如AtMYC2、AtMYC3、AtMYC4、TT8、GL3、EGL3、JAMYC2、JAMYC10、NtMYCa及3个橡胶 HbMYCs。橡胶 HbMYC2、HbMYC3 和 HbMYC4 与拟南芥 AtMYC2、AtMYC3和AtMYC4的结构域特征非常相似,说明3个橡胶HbMYCs可能也受到茉莉酸信号调控。(5)酵母双杂结果显示,HbMYC2 能与 HbJAZ7、HbJAZ8、HbJAZ1 和 HbJAZ11发生互作;HbMYC3 能与其中的 HbJAZ1、HbJAZ7、HbJAZ8、HbJAZ9、HbJAZ10和 HbJAZ11 发生互作;而 HbMYC4 能与 HbJAZ1、HbJAZ7、HbJAZ9 和 HbJAZ11发生互作,说明HbMYC转录因子与HbJAZs之间的互作存在着蛋白序列特异性。(6)基因差异表达分析结果显示,HbMYC2和HbMYC3的表达受伤诱导,而HbMYC4的表达却受到伤抑制;外源茉莉酸对HbMYC2和HbMYC3的表达上调,但对HbMYC4的表达影响较小;ABA处理的表达模式与外源茉莉酸处理的表达模式相似,刺激HbMYC2和HbMYC3上调表达,但却抑制HbMYC4的表达。(7)数字表达谱(Digital Gene Expression,DGE)分析发现,茉莉酸处理1h后上调表达的基因数有3662个,下调的基因有2039个,其中差异表达最多是植物与病原互作(Plant-pathogeninteraction)信号通路相关基因,而表达差异最明显的基因是与a-亚油酸代谢(alpha-linolenic acid metabolism)信号通路相关;茉莉酸处理3h后,上调表达的基因数为4257个,下调的基因有2511个,其中数量最多的是代谢信号通路(metabolicpathways)相关基因,而表达差异最明显的基因是与氮代谢(nitrogen metabolism)信号通路相关。(8)为了筛选橡胶HbMYCs转录因子的靶基因,本实验在前期曾利用酵母单杂交技术筛选与HbMYCs转录因子互作的顺式作用元件,发现HbMYCs转录因子能与G-box(CACGTG)发生互作。利用橡胶启动子顺式作用元件扫描软件HCES进行分析发现,橡胶基因组有2800个基因的启动子携带G-box顺式作用元件,其中40个与橡胶产排胶相关。(9)酵母单杂(Yeast Two Hybrid,Y1H)实验表明,HbMYC2、HbMYC3 和HbMYC4能够分别与蔗糖转移酶ST2的启动子发生互作,从而在酵母细胞中激活ABAR报告基因的表达,对真菌毒素Aureobasidin A(AbA)产生抗性而生存下来。酵母能够生长的培养基上AbA的浓度越高,说明互作越强烈。本文的Y1H实验数据显示,在高达800ng/mL的培养基上,酵母依然生长良好,说明HbMYCs与ST2启动子之间存在强烈的互作。本文的研究结果向揭示茉莉酸信号调控巴西橡胶树创伤反应及胶乳生物合成踏出了坚实的一步,对橡胶产胶基础研究及生产技术提升具有重要意义。