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结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）引起的传染性疾病，现在仍是危害全人类健康的主要慢性传染病之一。目前，细菌学检查依然为结核病诊断的金标准，尚无快速、有效诊断结核病的方法，无法对结核病进行有效的早期诊断。同时，卡介苗（Bacillus Calmette Guerin,BCG）作为全球范围内唯一获准广泛使用的结核疫苗，其保护力随年龄的增长而下降，研究已证实BCG对成人结核病保护率不稳定，在0～80%之间，且不同BCG疫苗株之间随着保护性抗原或表位丢失而导致保护力的差异。因此，我们对结核分枝杆菌新特异性蛋白进行研究，为研制结核病新型诊断试剂和抗结核新疫苗提供基础，对有效控制结核病流行具有重要意义。 本研究在前期采用基因组学和生物信息学技术对H37Rv抗原表位研究筛选和文献检索分析等基础上，选取可能具有较好抗原性的结核分枝杆菌蛋白进行抗原性评价研究，以期发现具有良好潜在应用前景的新抗原。 本研究以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的DNA为模板，PCR扩增得到目的基因，构建含有目的基因的重组质粒，转化入原核表达系统表达各重组蛋白，使用镍离子亲和层析和离子交换层析的方法对重组蛋白进行纯化，得到纯度较好的重组蛋白，用BCA法对蛋白的浓度进行测定。分别用酶联免疫吸附试验（ enzyme-linked immunosorbnent assay, ELISA）检测外周血清特异性抗体（IgG）和酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospotassay,ELISPOT）检测重组蛋白刺激下外周血单核细胞伽马干扰素（interferon-γ, IFN-γ）释放水平，在体外分别从体液免疫和细胞免疫两方面评价重组蛋白的抗原性。 我们选择尚未见相关研究报道的Rv0446c、Rv0658c、Rv2201和Rv2318四个新蛋白进行了克隆、表达和纯化，获得纯度高于90%的重组蛋白，浓度分别为151.23μg/mL、149.96μg/mL、175.95μg/mL和175.69μg/mL。 研究建立了使用重组蛋白检测血清抗体（IgG）反映蛋白体液免疫抗原性的ELISA方法，其中，Rv0446c、Rv0658c、Rv2201和Rv2318作为抗原的最佳包被浓度分别为15.1μg/mL、15.0μg/mL、8.8μg/mL和17.6μg/mL；血清最佳稀释度均为1∶100，二抗最佳稀释度均为1:10000。共对222份人血清样本，包括106份结核患者血清、53份肺部其他疾病患者血清和63份健康志愿者血清，分别用四种新蛋白作为抗原，进行了血清抗体（IgG）检测。Rv0446c、Rv0658c、Rv2201和Rv2318灵敏度分别为49.1%、53.8%、53.7%和60.4%，特异度分别为66.4%、65.5%、69.0%和68.1%，曲线下面积（area under curve, AUC）分别为0.572、0.607、0.637和0.664。 使用ELISPOT进行抗原刺激下外周血单核细胞释放IFN-γ的检测，评价四种结核分枝杆菌新蛋白的细胞免疫抗原性。分别采集全血样本169份，包括64份结核病患者全血、48份肺部其他疾病患者全血和57份健康志愿者全血，分离得到外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），采用融合蛋白CFP10- ESAT6和Ag85B两种蛋白作参照，确定克隆重组的新蛋白作为抗原的最佳刺激浓度为20.0 μg/mL。用纯化好的四种新蛋白作为刺激原，检测产生IFN-γ的淋巴细胞数，其中Rv0658c与结核病患者、肺部其他疾病患者和健康志愿者PBMCs共同培养后均出现细胞坏死或凋亡的现象，没有获得检测结果。其他三个重组蛋白Rv0446c、Rv2201和Rv2318细胞免疫功能检测的灵敏度分别为24.14%、59.65%和32.73%，特异度分别为92.93%、83.33%和89.58%。 本研究成功对四种结核分枝杆菌新蛋白Rv0446c、Rv0658c、Rv2201和Rv2318进行分子克隆、表达和纯化，获得高纯度的重组蛋白，并且，体外试验证实四种新蛋白均具有较好的体液免疫抗原性，Rv0446c、Rv2201和Rv2318具有较好的细胞免疫抗原性，为结核病的诊断和疫苗的研究提供一定的基础。