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目的：肿瘤干细胞的存在让肿瘤更具侵袭性、耐药性以及转移性。目前关于肿瘤代谢的研究集中在混合细胞群体的层面,缺乏针对肿瘤干细胞代谢特征以及其分子调控机制的研究。本研究采用三维软蛋白基质胶(3D Fibrin)培养获取的肿瘤再生细胞(TRCs)为模型,探究线粒体型磷酸烯醇式丙酮酸(PCK2)的表达变化对肿瘤干细胞代谢的影响。方法：(1)RT-PCR和Western blot检测比较小鼠黑色瘤细胞B16-F1、小鼠肝癌细胞H22、人喉癌细胞Hep-2以及人黑色素瘤细胞A875培养获得的TRCs和相应对照细胞中PCK2的表达. RT-PCR和Western blot检测比较小鼠胚胎干细胞(mESCs)在分化与未分化状态下PCK2的表达。流式分选小鼠黑色素瘤细胞B1-F1中CD133+细胞亚群,RT-PCR检测比较CD133+细胞亚群中PCK2的表达。收集两例黑色素瘤临床肿瘤病人标本,分离肿瘤细胞培养获取TRCs, RT-PCR检测两例病人标本TRCs中PCK2的表达。(2)检索TCGA数据库并分析PCK2的表达与肿瘤病人生存期是否相关。(3)构建PCK2过表达质粒载体,转染B16-F1TRCs,6小时后再将其尾静脉接种小鼠,24天后观察小鼠肺部成瘤情况；B16-F1细胞转染PCK2 siRNA,6小时后再将其尾静脉接种小鼠,24天后观察小鼠肺部成瘤情况：构建PCK2 Tet-On细胞株,将其种入3D fibrin胶中,在添加或不添加多西环素的情况下,比较克隆大小和数目,并比较TRCs对顺铂的敏感性。将PCK2 Tet-On细胞株,接种到小鼠皮下,分别用添加或不添加多西环素(Dox)的水喂养,比较该细胞在小鼠皮下的成瘤能力。(4)分析比较B16-F1 TRCs和B16-F1葡萄糖消耗以及乳酸释放量；过表达PCK2,比较B16-F1 TRCs葡萄糖消耗和乳酸释放量；比较B16-F1 TRCs和对照细胞TCA循环中间物柠檬酸的含量；过表达PCK2,检测B16-F1 TRCs柠檬酸的含量变化；siRNA沉默异柠檬酸脱氢酶IDH3A以及苹果酸脱氢酶MDH2,观察B16-F1 TRCs和对照细胞的生长情况并检测其葡萄糖消耗；siRNA沉默柠檬酸转运蛋白SLC25A1、柠檬酸裂解酶ACLY、脂肪酸合酶FASN以及苹果酸酶ME1,检测B16-F1 TRCs葡萄糖消耗；比较B16-F1 TRCs和对照细胞TCA循环代谢中间产物延胡索酸的含量；过表PCK2,检测B16-F1 TRCs中延胡索酸含量变化；Western blot检测B16-F1 TRCs和对照细胞中HIF1α和HIF2α的表达；调控PCK2表达后,Western blot检测B16-F1 TRCs中HIF1α和HIF2α的表达；用质谱检测比较B16-F1 TRCs和对照细胞中DNA的5羟甲基胞嘧啶和5甲基胞嘧啶的含量：过表达PCK2,检测B16-F1 TRCs DNA中5羟甲基胞嘧啶和5甲基胞嘧啶的含量变化；Seahorse XF24设备检测比较B16-F1 TRCs和对照细胞的耗氧量水平；过表达PCK2后,检测B16-F1 TRCs耗氧量变化：不同浓度的电子传递链复合物I抑制剂(Rotenone)、复合物V抑制剂寡霉素(Oligomycin)分别处理B16-F1 TRCs和对照细胞,用CCK-8试剂盒检测比较细胞增殖情况,并检测葡萄糖消耗量。结果：(1)B16-F1细胞、H22细胞、Hep-2细胞和A875细胞TRCs相对于普通肿瘤细胞,PCK2呈下调表达。mESC处于未分化状态时低表达PCK2。PCK2在B16-F1 CD133+细胞亚群中的表达低于CD133细胞亚群。两例黑色瘤病人标本TRCs中PCK2呈低表达。(2)PCK2的表达与黑色素瘤、肺癌和胃癌病人的总生存期相关。(3)B16-F1 TRCs过表达PCK2后,在小鼠肺部形成转移斑点数目减少；B16-F1转染siRNA沉默PCK2后,在小鼠肺部形成转移斑点数目增多；将PCK2 Tet-On稳定细胞株种入3D fibrin中,在添加多西环素培养下,形成克隆的体积变小、数目减少,并且对顺铂敏感性变差。PCK2 Tet-On稳定细胞株接种小鼠皮下,多西环素喂养组小鼠成瘤能力减弱。(4)与B16-F1相比,B16-F1TRCs葡萄糖消耗增多,乳酸释放量增多；过表达PCK2后,B16-F1 TRCs葡萄糖消耗减少,乳酸产生量降低；B16-F1 TRCs柠檬酸的含量增高；过表达PCK2后,B16-F1 TRCs中柠檬酸的含量减少；B16-F1 TRCs沉默异柠檬酸脱氢酶IDH3A以及苹果酸脱氢酶2后,克隆生长没有明显变化,葡萄糖消耗也没有明显差异,而B16-F1细胞生长明显受抑制,葡萄糖消耗减少；沉默柠檬酸转运蛋白SLC25A1、柠檬酸裂解酶ACLY、脂肪酸合酶FASN以及苹果酸酶ME1,B16-F1 TRCs葡萄糖消耗明显减少；B16-F1 TRCs中延胡索酸含量增多；过表达PCK2后,B16-F1TRCs中延胡索酸含量降低；在缺氧的情况下,B16-F1 TRCs中HIF蛋白的表达升高：过表达PCK2后,B16-F1 TRCs中HIF蛋白表达降低；B16-F1 TRCs细胞DNA的5-羟甲基化程度降低；过表达PCK2后,B16-F1 TRCs中DNA的5-羟甲基化程度增高；B16-F1 TRCs细胞耗氧量降低；过表达PCK2后,B16-F1 TRCs耗氧量增高：与B16-F1细胞相比,电子传递链抑制剂Rotenone和Oligomycin对B16-F1 TRCs细胞的抑制作用更差。结论：肿瘤再生细胞相对于对照细胞下调表达PCK2, PCK2低表达对维持肿瘤再生细胞的生长和成瘤至关重要,而且PCK2的表达与肿瘤病人的总生存期密切相关。过表达PCK2后,B16-F1 TRCs细胞体外生长受抑制,体内致瘤能力减弱。B16-F1 TRCs糖酵解能力增强,氧化磷酸化水平降低。B16-F1 TRCs下调表达PCK2,发挥的生物学效应的内在机制可能是：①生成更多的柠檬酸,用于合成脂肪酸；②中间代谢物延胡索酸含量增高,进而影响缺氧诱导因子的表达,对细胞糖酵解产生影响；③中间代谢物延胡索酸含量增高,进而影响DNA羟甲基化程度,维持细胞的未分化状态；④降低细胞氧化磷酸化的水平,减少氧消耗。这些发现揭示PCK2的下调表达是黑色素肿瘤再生细胞重要的代谢标志,在其代谢过程中发挥重要调节作用,有望作为黑色素瘤治疗的靶标。