论文部分内容阅读
四氢异喹啉生物碱家族化合物以其独特丰富的化学结构，以及其良好的抗肿瘤和抗菌活性已经受到了研究者们长达四十年的关注。萘啶霉素是最早分离得到四氢异喹啉类生物碱，良好的生物活性和特殊的骨架结构使其具有重要的研究意义。本论文的主要工作就是在稳定并提高萘啶霉素产量的基础上，以萘啶霉素为主体来研究四氢异喹啉家族的共性以及萘啶霉素结构上的特性。 首先对萘啶霉素生物合成基因簇中的调控基因进行了体内基因敲除和回补实验，确定了napR3的正调控功能。在野生型中将正调控基因napR3进行倍增，使萘啶霉素的产量提高了5倍。基于此结果，在后续的工作我们同样将napR3在产生萘啶霉素相关中间体的突变株中进行倍增，目标化合物都有不同程度增产，利于我们对化合物的分离纯化。 接下来对共性基因研究主要针对萘啶霉素基因簇中未归属功能的FAD依赖的氧化还原酶基因napU和短链脱氢酶基因napW。它们与番红霉素基因簇中的sfmCy1和sfmO1有着同源性，目前只通过体内实验已经证实与番红霉素的生物合成相关。对于napU和napW我们通过基因敲除和回补实验证实其与萘啶霉素生物合成的相关性，并从napU基因敲除突变株的发酵产物中分离得到缺失C-7羟基的化合物NDM-401。通过体外酶活实验证实NDM-401在NapU的作用下能快速的转化为萘啶霉素，并进一步转化为化合物NDM-415，并通过时间梯度发酵实验证实NDM-415并非体外酶活的副产物，而是真实存在于萘啶霉素的生物合成途径中。由于NapU属于分泌蛋白，暗示以上反应可能是在胞外完成。通过点突变实验，我们确定NapU中的His110和Cys170负责FAD辅酶的共价结合，Tyr186和Tyr486参与反应。而NapW的体外酶活实验显示，在NapW能催化NDM还原为NDM-401。基于唐满城博士对NapW的同源蛋白SfmO1的体外测活结果，我们推测化合物NDM-401的产生是由于NRPS蛋白催化核心结果形成后生成的亚胺中间体被NapW还原的结果。 综合以上结果，我们认为在萘啶霉素、番红霉素，甚至四氢异喹啉家族碱的生物合成中暗藏着一个精密的自身抗性机制:当化合物在体内装配和后修饰过程中，产生具有DNA烷基化功能的活性位点会被暂时封闭;直到排出宿主体外才被重新活化再生，具有了较强的生物活性。 最后是对萘啶霉素结构特性的研究。在萘啶霉素中含有一个独特的噁唑烷结构，通过分析我们推测负责这个噁唑烷结构形成的基因可能为未知基因napP和napF。通过体内实验确定了其与萘啶霉素生物合成的相关性，并在napP和napF的基因缺失突变株中都发现了新化合物NDM-348，鉴定其为噁唑烷结构缺失的结构，因此我们可以确定napP和napF与噁唑烷结构形成相关。同时，基于此研究成果，我们尝试将奎罗卡星与萘啶霉素的后修饰途径进行组合生物合成:在将qnc2/3基因异源回补于napP基因缺失突变株所得的重组突变株的发酵产物中，检测到了符合我们预期的组合生物合成产物，其结构有待分离鉴定。