极端嗜热古菌染色质蛋白对DNA聚合酶链取代活性调控作用的研究

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DNA的复制属于半不连续复制。其中前导链DNA的复制为连续的,而后随链DNA的复制只能以冈崎片段为单位分段进行。将这些离散的冈崎片段连接为完整新链的过程被称为冈崎片段的成熟。在后随链DNA复制中,DNA聚合酶除了合成冈崎片段外,还可通过其内在的链取代能力参与冈崎片段的成熟。DNA聚合酶对下游片段5端的取代,可使冈崎片段中的RNA引物被核酸酶降解,使得DNA连接酶完成对冈崎片段的连接。因此,DNA聚合酶在后随链DNA的复制过程中发挥重要的作用。本文对极端嗜热古菌DNA聚合酶在冈崎片段成熟过程中的作用及其调控进行了研究。本研究分为三个部分:  第一部分研究了两种极端嗜热古菌----硫磺矿硫化叶菌和炽热火球菌中DNA聚合酶的链取代能力。在由长度为36nt的DNA引物与72 nt的小环DNA退火形成环形引发模板P36/C72上,这些DNA聚合酶都可以合成超过72 nt的产物,说明都具有一定的链取代活性。其中硫磺矿硫化叶菌DNA聚合酶B1(SsoPolB1)的链取代长度最长可达~3000 nt,显示了较强的链取代活性。  第二部分研究了硫化叶菌中两种染色质蛋白Sso7d和Cren7对SsoPolB1链取代活性的调控作用。在P36/C72模板上,两种蛋白均可将SsoPolB1的链取代长度由几千nt缩短到仅3-4 nt,表现出对SsoPolB1链取代能力的强烈抑制作用。而当模板的引物中含有一定长度的5端RNA时,SsoPolB1对RNA的取代却不受染色质蛋白的影响。另外,染色质蛋白对SsoPolB1链取代活性的调控作用不受PCNA和RFC的影响。Sso7d和Cren7只抑制SsoPolB1对DNA的链取代而不影响其对RNA的取代说明,染色质蛋白的作用具有一定的选择性。这种选择性的产生可能是由于染色质结合并稳定双链DNA的能力强于RNA∶DNA杂合双链。炽热火球菌组蛋白同样对炽热火球菌DNA聚合酶的链取代产生相似的调控作用。我们认为,在冈崎片段成熟过程中,染色质蛋白可通过抑制DNA聚合酶对DNA的链取代来减少其对冈崎片段中DNA部分的过度取代;同时,染色质蛋白不抑制DNA聚合酶对引物5端RNA进行取代的特点又保证了RNA引物可被全部取代并在后续步骤中被准确移除。据此,我们提出了DNA聚合酶和染色质蛋白参与冈崎片段成熟的模型。  第三部分研究了硫磺矿硫化叶菌单链DNA结合蛋白SSB对后随链DNA复制的影响。我们发现,SSB在高温下会发生构象上的可逆变化。通过比较SSB在不同类型模板上对SsoPolB1延伸活性的影响,发现SSB在含有非开放末端的单链DNA上对SsoPolB1产生的抑制作用强于其在末端开放单链DNA上的作用。我们据此提出了SSB在后随链DNA复制过程中脱离单链DNA模板的模型。
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