山葡萄‘双红’与葡萄霜霉菌互作的分子机制研究

来源 :中国农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lskiba
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由葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola(Berk.And Curt.)Berl.And de Toni)引起的葡萄霜霉病(downy mildew)是葡萄生产中最具毁灭性的病害之一。本研究以具有优良霜霉病抗性的山葡萄‘双红’为材料,探究葡萄与霜霉菌的分子互作机制,以期为葡萄分子抗病育种和探索新的葡萄霜霉病防治手段提供理论依据。本研究首先从全国主要葡萄种植区采集了118份葡萄霜霉菌样品,利用单孢子梗分离的方法获得206个霜霉菌单株。对这些葡萄霜霉菌进行群体遗传分析后发现,中国葡萄霜霉菌呈现出丰富的基因型多样性,但是群体间遗传分化不明显。从中挑选了29株菌分别接种到6个具有不同霜霉病抗性水平的葡萄上,进行致病力分析。结果显示:霜霉菌表现出明显的致病力多样性;其中,菌株ZJ-1-1能成功侵染高抗的山葡萄‘双红’,而在其它寄主上表现出强致病力的菌株JL-7-2在‘双红’上却引起明显的坏死。根据葡萄霜霉菌的致病力分析和组织学观察,确定了在霜霉菌菌株JL-7-2和ZJ-1-1分别接种山葡萄‘双红’后0、12、24、48和72 h取样用于转录组测序。基于RNA-Seq的基因表达谱分析发现在非亲和互作的早期有37个抗病基因(R)和防卫相关的信号传递途径和次级代谢途径被激活,例如SA、JA和MAPK信号传递途径和苯丙烷类代谢途径。然而,Ca2+信号传递途径、脂肪酸合成途径和光合作用却在非亲和互作的早期被显著的抑制。从山葡萄‘双红’的比较转录组分析中挖掘到的37个候选R基因中,成功克隆了1个R基因,VaRGAl。特征与功能研究表明:在山葡萄‘双红’受到霜霉菌入侵和非生物胁迫(干旱胁迫和盐胁迫)的早期VaRGAl基因被强力地诱导;VaRGAl蛋白定位在植物细胞的细胞膜、细胞质和细胞核;VaRGAl的过表达可能通过激活SA信号途径和苯丙烷类代谢途径显著地提高烟草对卵菌的抗病力;VaRGAl过表达同样可以通过激活SA途径改善烟草的耐旱和耐盐能力。通过对葡萄霜霉菌菌株ZJ-1-1和JL-7-2的转录组从头组装,借助生物信息学手段和RxLR类效应因子的保守模块结构,本研究从菌株zJ-1-1和JL-7-2分别挖掘到31个和21个RxLR类效应因子。通过PCR扩增,从菌株JL-7-2的21个预测的RxLR类效应因子中成功克隆了14个,进一步的研究发现:这些效应因子在菌株JL-7-2侵染不同抗性寄主的过程中呈现出截然不同的表达模式;绝大多数效应因子都定位在细胞核;所有的效应因子均能抑制Bax.INF1和Avr3a-R3a引起的PCD。通过对效应因子功能域分析,选取了含有介导蛋白-蛋白互作的TPR结构域的效应因子PvRxL13作为诱饵去筛选霜霉菌侵染的‘赤霞珠’cDNA文库,发现该效应因子可以与葡萄的转录因子HY5互作。PvRxL13的截断实验表明核定位信号(NLS)和TPR结构域是PvRxL13的毒力活性以及与HY5互作必不可少的。效应因子PvRxL13和HY5在含有GUS报告基因的烟草叶片中瞬时表达发现PvRxL13可以抑制HY5的转录活性。HY5基因的瞬时沉默可以明显降低烟草叶片的抗病性。类似地,PvRxL13过表达增强了烟草的感病性。
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