【摘 要】
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本论文分为两个部分。本文第一部分工作,载脂蛋白B m RNA编辑酶,催化多肽-1,即APOBEC1(Apolipoprotein B m RNA editing enzyme,catalytic polypeptide 1,简称A1)是APOBEC家族成员,在辅助因子A1CF(APOBEC1 complemetation factor)和/或RNA结合模体蛋白RBM47(RNA binding m
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本论文分为两个部分。本文第一部分工作,载脂蛋白B m RNA编辑酶,催化多肽-1,即APOBEC1(Apolipoprotein B m RNA editing enzyme,catalytic polypeptide 1,简称A1)是APOBEC家族成员,在辅助因子A1CF(APOBEC1 complemetation factor)和/或RNA结合模体蛋白RBM47(RNA binding motif protein 47)的存在下特异性结合载脂蛋白B m RNA(Apolipoprotein B m RNA,Apo B m RNA)并催化脱氨基化第6666位胞嘧啶(C6666)转变为尿嘧啶(U6666),产生载脂蛋白B截短体Apo B48,从而参与调控与脂质代谢相关的生理过程,但具体机理不清楚。此外,A1还调控多种细胞因子转录物的表达进而参与肿瘤病变,或编辑病毒基因组从而抑制部分逆转录病毒的复制。为了后期结构解析及药物筛选需要,侧重APOBEC1、A1CF及RBM47样品制备与结晶条件初筛。为此我们尝试了多种表达质粒及优化蛋白纯化方法后,发现常规的表达体系中A1通常以包涵体形式表达,使用促溶标签GST与MBP,或在缓冲液中添加甘油或去污剂,或使用分子伴侣p Gro7共表达,均无法获得可溶的A1蛋白。针对A1的包涵体表达,我们设计并尝试了一系列表达纯化方法,对包涵体使用尿素变复性,用毕赤酵母菌株表达以及突变体表达均失败。最后,我们使用含较弱启动子的质粒p MAL-c4X-M在大肠杆菌表达体系中实现了A1重组蛋白的可溶表达,对纯化步骤进行简化优化后,仅需一次亲和纯化和一次凝胶色谱分离纯化,就能得到纯度较高,呈二聚体状态的目标蛋白,每升大肠杆菌能获得蛋白约3mg。我们通过大肠杆菌表达体系表达纯化大量可溶辅助蛋白,凝胶分子筛实验表明蛋白状态均一,A1CF以单体形式存在,RBM47以二聚体形式存在,它们具有核酸结合活性。这些工作为后期它们与Apo B m RNA复合物组装,开展结构研究奠定了基础。第二部分工作尝试了非血红素铁(II)和α-酮戊二酸依赖性氧化酶Prh A与过氧化酶Ftm Ox1的功能互换改造。突变Prh A的关键位点V150和A232能引入其他氧化酶的功能。将Prh A-A232替换为Ftm Ox1的关键位点Y224,我们构建了Prh A-A232Y突变体,尝试将Prh A改造为过氧化酶。将突变体克隆到载体p ET28a上,在大肠杆菌表达体系中表达纯化了四聚体和二聚体两种状态的Prh A-A232Y,选择Prh A-A232Y二聚体蛋白作为研究对象,选择与Prh A原底物preaustinoid A1具有相似结构的几种小分子化合物测试Prh A-A232Y,还未发现有催化过氧化反应的活性,还需继续筛选底物或重新设计突变位点。
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