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目的:脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）是由脑缺血缺氧引起的原发性损伤和恢复血流再灌注后的继发性损伤组成。CIRI损伤性刺激可通过低氧诱导因子（hypoxiainducible transcription factors,HIFs）激活血管基底膜降解,脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMEC）增殖、迁移,诱导血管新生,发挥一定代偿作用[1],但这种内源性的修复作用是有限的,且新生的血管由于结构不成熟、通透性高,易发生血管渗漏,增加脑出血和脑水肿的风险[2]。因此,促进CIRI后的血管新生及新生血管的成熟以完善血管生成代偿、为神经元提供营养支持,是CIRI后神经修复的重要环节。课题组前期研究发现,天麻酚性成分中的对甲氧基苄醇、4-羟基苯甲醛、3,4-二羟基苯甲醛（以下简称“3#、4#、8#”）能增加大脑中动脉缺血再灌注（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）损伤模型大鼠脑皮层微血管密度、升高脑血流量,改善神经功能,其中3#可上调Smad-3 m RNA表达。Smad-3是促新生血管成熟信号通路TGF-β1/Smad重要的下游蛋白[3]。提示天麻酚性成分具有促新生血管成熟的作用,其作用机制可能是通过TGF-β1/Smad信号通路介导。BMEC分泌的TGF-β1可通过TGF-β1/Smad信号通路刺激平滑肌细胞（smooth muscle cell,SMC）分泌纤连蛋白并促进其增殖、招募间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）聚集于损伤组织处等方式,完善周细胞（Pericyte,PC）的覆盖、减少血管扭曲和出血,从而促进新生血管的成熟。为进一步明确3#、4#、8#促新生血管成熟的作用机制是否与调控TGF-β1/Smad信号通路有关,本研究通过体内复制大鼠MCAO/R模型,体外复制大鼠BMEC氧糖剥夺再灌注（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型,从动物、细胞水平观察3#、4#、8#对TGF-β1/Smad信号通路相关因子的调控作用。方法:1.天麻酚性成分对MCAO/R模型大鼠脑组织TGF-β1、ALK5、Smad-2、Smad-3蛋白表达影响的研究（1）采用线栓法复制大鼠MCAO/R模型,通过激光散斑仪（laser speckle imaging,LSI）监测脑血流量（cerebral blood flow,CBF）的变化,并以神经病学评分（Longa 5分法）为指标评价MCAO/R模型稳定性,取缺血2h、CBF下降至42～53%,再灌注后CBF恢复至70%以上,且神经病学评分为1-3者纳入实验用。将造模成功的大鼠再随机分为模型组、丁苯酞（Butylphthalidle,NBP）组及受试物3#、4#、8#组。NBP组与受试物组于MCAO/R后6h首次灌胃给予NBP（80mg/kg）、3#（20mg/kg）、4#（20mg/kg）、8#（10mg/kg）,直至MCAO/R后7d、14d、28d;假手术组与模型组使用等体积的溶媒灌胃。实验分为7d、14d、28d三批进行指标检测。（2）取大鼠损伤侧脑皮层组织,采用蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）法检测脑组织TGF-β1、活化素受体样激酶5（Activin receptor-like kinase5,ALK5）、Smad-2、Smad-3的表达,从整体水平观察3#、4#、8#对TGF-β1/Smad信号通路的调控作用。2.天麻酚性成分对BMEC OGD/R模型TGF-β1、ALK5、Smad-2、Smad-3 m RNA表达影响的研究根据第一部分结果表明3#、4#干预7d、14d、28d能明显促进MCAO/R模型脑组织ALK5、Smad-2和Smad-3的表达,本部分从细胞水平进一步考察3#、4#对TGF-β1、ALK5、Smad-2、Smad-3 m RNA的调控作用。（1）OGD/R模型复制:体外提取分离纯化得到原代BMEC。利用三气培养箱,复制BMEC缺糖缺氧6h复糖复氧4h损伤模型。使用CCK-8法检细胞活力,细胞存活率降至50%为造模成功标准。（2）将BMEC随机分为8个组,即:正常组、模型组、受试物3#高(5×10-4mol/L)、中(5×10-5mol/L)、低(5×10-6mol/L)剂量组,受试物4#高(5×10-4mol/L)、中(5×10-5mol/L)、低(5×10-6mol/L)剂量组。缺糖缺氧6h后,给予含不同剂量受试物的正常培养基进行复糖复氧4h处理。（3）采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）法检测细胞中TGF-β1、ALK5、Smad-2、Smad-3的m RNA的表达,从细胞水平观察3#、4#对TGF-β1/Smad信号通路的调控作用。结果:1.天麻酚性成分对MCAO/R模型大鼠脑组织TGF-β1、ALK5、Smad-2、Smad-3蛋白表达影响的研究（1）与假手术组比较:7d模型组TGF-β1蛋白表达升高（P<0.05）,Smad-3蛋白表达降低（P<0.001）;14d模型组TGF-β1蛋白表达升高（P<0.05）,Smad-2、Smad-3蛋白表达降低（<0.05、P<0.001）;28d模型组TGF-β1蛋白表达升高（P<0.001）,Smad-3蛋白表达降低（P<0.01）。（2）3#:与模型组比较,干预7d,MCAO/R模型大鼠脑Smad-3蛋白的表达升高（P<0.001）;干预14d,MCAO/R模型大鼠脑ALK5蛋白的表达升高（P<0.01）。（3）4#:与模型组比较,干预7d,MCAO/R模型大鼠脑Smad-2、Smad-3蛋白的表达升高（P<0.001、P<0.05）;干预14d,ALK5、Smad-2的表达升高（P<0.05）;干预28d,ALK5、Smad-3的表达升高（P<0.05）。（4）8#:干预7d、14d、28d,与模型组比较,未见升高MCAO/R模型大鼠脑组织TGF-β1、ALK5、Smad-2、Smad-3蛋白的作用。2.天麻酚性成分对BMEC OGD/R模型TGF-β1、ALK5、Smad-2、Smad-3 m RNA表达影响的研究（1）用CCK-8法检测OGD/R模型复制情况:经OGD6h/4h后的BMEC存活率降低（P<0.01）。（2）与正常组比较:模型组TGF-β1、ALK5、Smad-2、Smad-3 m RNA的表达均升高（P<0.05、P<0.01）。（3）3#:与模型组比较,中剂量(5×10-6mol/L)组ALK5 m RNA的表达升高（P<0.05）,高剂量(5×10-4mol/L)组Smad-2、Smad-3 m RNA的表达升高（P<0.01、P<0.01）。（4）4#:与模型组比较,低剂量(5×10-6mol/L)组Smad-3 m RNA的表达升高（P<0.01）,中剂量(5×10-5mol/L)组TGF-β1 m RNA的表达降低（P<0.01）,高剂量(5×10-4mol/L)组TGF-β1 m RNA的表达降低（P<0.05）、Smad-3 m RNA的表达升高（P<0.01）。结论:对甲氧基苄醇、4-羟基苯甲醛促血管成熟的作用机制可能与BMEC介导TGF-β1/Smad信号通路中的ALK5、Smad-2、Smad-3因子上调相关。