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本文利用TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)对RD细胞进行分化诱导，并对其分化机制以及分化过程中早期分化标志一生肌蛋白基因启动子区染色质的重塑以及转录相关因子的结合进行研究，为横纹肌肉瘤的临床治疗提供一定的理论依据。
染色质修饰酶通过对染色质的修饰，对染色质的结构进行调整，促进或阻遏转录因子与DNA的结合，从而对基因的转录起激活或抑制作用。染色质免疫沉淀(Chromatin Imunoprecipitation，ChiP)分析是近些年发展起来检测蛋白因子在体内与染色质的结合，进而为蛋白因子参与染色质水平基因转录调控提供证据的方法。本研究运用该方法，检测了TPA诱导的RD细胞分化过程中，肌细胞分化决定因子MyoD、染色质重塑复合体SWI/SNF催化亚基BRGl、乙酰转移酶p300和p300/CBP相关因子PCAF与生肌蛋白基因启动子区染色质的结合情况。并应用质粒瞬时共转染及竞争性RT-PeR的方法进一步研究了PKC、p38、PCAF、p300以及BRGl对生肌蛋白基因启动子活性的影响。
一、RD细胞分化过程中的相关信号途径。
RD细胞，主要呈圆形和多边形，少数纺锤形；而TPA诱导处理后，RD细胞逐渐呈现典型的分化形态，如胞体伸长，细胞内颗粒物增多，出现多核肌纤维类似结构等(图1)。与对照相比，TPA诱导分化的RD细胞，其生肌蛋白(骨骼肌早期分化标心=kz)和肌球蛋白重链(Myosin Heavy Chain，骨骼肌晚期分化标志)的mRNA水平随TPA作用时间的增加而增加(图2)；而且生肌蛋白蛋白水平在24 h后表现明显的升高，而肌球蛋白重链蛋白水平在TPA诱导48h后也表现明显的增强(图3)。提示TPA的诱导处理可能激活了生肌蛋白的完全表达，从而指导RD细胞重新进入并完成分化。PKC抑制剂GF109203X的处理可抑制TPA诱导的RD细胞生肌蛋白和肌球蛋白重链的蛋白表达量的升高(图4)；p38抑制剂SB203580的处理，也可明显抑制TPA诱导的RD细胞分化过程中生肌蛋白和肌球蛋白重链蛋白表达的增加以及mRNA水平的升高(图5，6)。提示PKC与p38是TPA诱导的RD细胞分化的必经途径。
二、RD细胞分化过程中染色质调整蛋白及修饰因子与生肌蛋白基因启动子的结合分析。TPA能诱导RD细胞分化，表明RD细胞中存在行使SWI/SNF复合物功能所需的辅助因子。我们发现，横纹肌肉瘤RD细胞仅表达染色质重塑复合物SWI/SNF的ATPase催化亚基BRGl，而不表达BRM(图7)。
ChIP实验结果表明(图8)，(1)未经TPA诱导的对照RD细胞中，MyoD、p300均可结合到生肌蛋白基因启动子，而PCAF与BRG1在对照RD细胞中并不与生肌蛋白基因启动子结合。(2)在TPA诱导RD细胞分化6h后，PCAF开始结合于生肌蛋白基因启动子，而诱导12h后，BRG1开始与生肌蛋白基因启动子结合。p38抑制剂SB203580的处理，抑制BRG1与生肌蛋白基因启动子的结合，却并不影响MyoD，D300以及TPA诱导的PCAF与生肌蛋白基因启动子的结合。(3)RD细胞中MyoD呈非乙酰化状态，在TPA诱导分化6h后MyoD开始被乙酰化(图9)。
三、RD细胞分化过程中染色质调整蛋白及修饰因子对生肌蛋白基因启动子活性的影响。
(1)将含有报告基因表达质粒pREP4m-myog-CAT和转染内参照质粒pM-CAT瞬时共转染RD细胞之后加入TPA进行诱导处理，启动子活性分析结果表明，TPA可以增强生肌蛋白基因的启动子活性，而SB203580的处理则抑制TPA对生肌蛋白基因的诱导增强效应(图14)，进一步证实了p38是TPA激活生肌蛋白基因表达的必经环节。
(2)PKCα表达质粒或p38表达质粒pREP4m-myog-CAT和pM-CAT瞬时共转染RD细胞，启动子活性分析结果表明，PKCα可以增强生肌蛋白基因的启动子活性，但p38对其无效应(图15)，提示p38对生肌蛋白基因表达的激活还需要其它因子的参与。
(3)PCAF表达质粒或p300表达质粒与pREP4m-myog-CAT和pM-CAT瞬时共转染RD细胞，启动子活性分析结果表明，PCAF可以增强生肌蛋白启动子的活性，但p300对生肌蛋白启动子无影响(图16)。PCAF与p38(或其显性负突变体)表达质粒的共转染实验结果表明，DN-p38抑制PCAF对生肌蛋白启动子活性的激活(IN 17)，表明PCAF在调节生肌蛋白基因的表达中可能依赖于p38的活性。转染实验结果还表明TSA的处理可以促进生肌蛋白基因的启动子活性(图18)。
(4)BRG1表达质粒(或其显性负突变体)与pREP4m-myog-CAT和pM-CAT瞬时共转染RD细胞后，进行TPA诱导，启动子活性分析结果表明，BRG1不影响生肌蛋白基因的启动子活性，但能促进TPA诱导的生肌蛋白基因启动子活性的增强，而DN-BRG1则抑制TPA对生肌蛋白基因启动子活性的激活作用(图19)。共转染实验结果还表明，DN-BRG1也抑制PKCα和 PCAF对生肌蛋白基因启动子活性的增强(图20，21)。这些结果均表明BRG1对于生肌蛋白基因的充分表达的是必需的。
综上结果，研究推测：TPA对RD细胞的诱导处理，促使PCAF结合于生肌蛋白基因的启动子，随后PCAF将结合于该启动子上的MyoD乙酰化，乙酰化后的MyoD构型可能发生改变，在激活的p38的共同作用下，将SWI/SNF染色质重塑复合物募集到生肌蛋白基因启动子，从而使该基因启动子区的染色质发生重塑，之后生肌蛋白基因高度表达，直至越过分化的门槛，最终促使RD细胞完成分化。