【摘 要】
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研究目的 （1）构建模式生物阴道毛滴虫衰老相关基因差异表达消减杂交文库，筛选阴道毛滴虫细胞衰老相关基因。（2）克隆阴道毛滴虫细胞的SIR2同源基因：Tv-SIR2-like。构建Tv-SIR2-like原核表达重组质粒及表达其重组蛋白。材料和方法 建立模式生物阴道毛滴虫的研究体系，即摄入正常热量的正常生长细胞模型和限制热量摄入的长寿细胞模型。在此基础上采用抑制性消减杂交技术构建阴道毛滴虫细胞衰老
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研究目的 （1）构建模式生物阴道毛滴虫衰老相关基因差异表达消减杂交文库，筛选阴道毛滴虫细胞衰老相关基因。（2）克隆阴道毛滴虫细胞的SIR2同源基因：Tv-SIR2-like。构建Tv-SIR2-like原核表达重组质粒及表达其重组蛋白。材料和方法 建立模式生物阴道毛滴虫的研究体系，即摄入正常热量的正常生长细胞模型和限制热量摄入的长寿细胞模型。在此基础上采用抑制性消减杂交技术构建阴道毛滴虫细胞衰老相关基因cDNA文库并分离和筛选细胞衰老相关基因。从阴道毛滴虫cDNA表达文库中筛选SIR2的同源基因，并对其序列保守结构域进行同源性分析。构建Tv-SIR2-like基因原核表达重组子，IPTG诱导表达目的基因融合蛋白。结果 成功构建正常生长型和长寿型模式生物阴道毛滴虫细胞差异表达基因消减杂交cDNA文库。从正向和反向两个消减杂交文库中各随机筛选出100个克隆进行酶切鉴定，分别得到250-700 bp大小不等的插入片段。测序及序列同源性分析结果显示，正向和反向两个消减杂交文库之间没有彼此重复的序列。从正常生长型阴道毛滴虫细胞的消减杂交文库中得到三个已知的基因（分别是：Fructose-1，6-bisphosphate aldolase，40S ribosomal protein及N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase），以及5个未知基因的序列，可能是新基因；从长寿型阴道毛滴虫细胞的消减杂交文库中也获得三个已知的基因（分别是：Cysteine proteinase，护劝兴丈李医‘笋脂石灸艺硕获夕之全毕业老戈.Ribulose及actin），以及5个未知基因的序列，也可能是新基因:其余序列为重复序列。从阴道毛滴虫细胞cDNA表达文库中成功筛选出寿命相关基因SIRZ的同源基因（Tv一sIRZ一like）。保守结构域序列同源性分析显示，Tv一sirZp一like氨基酸序列具有sirZp及其同源蛋白质特征性的三个保守结构域。Tv一SirZp一like可能具有sirZp及其同源蛋白质使转录沉默的功能。Southern blot显示，Tv一SIRZ一like在阴道毛滴虫细胞内为单拷贝基因。Northern blot结果显示，Tv一SIRZ一like mRNA大小约1，3 kb。成功构建Tv一SIRZ一like原核表达重组子，IPTG诱导表达及SDS一PAGE凝胶电泳分析结果显示，重组子在宿主菌大肠杆菌BLZI内表达出预期大小的GST融合蛋白质。结论采用PCR选择性消减杂交技术，构建了模式生物阴道毛滴虫衰老相关基因差异表达消减杂交文库，所筛选出的基因在阴道毛滴虫细胞寿命与衰老中的作用尚有待于进一步的研究证实。成功筛选、分离、克隆阴道毛滴虫细胞寿命相关基因Tv一SIRZ一like，序列同源性以及保守结构域分析表明Tv一SIRZ一like可能是SIRZ的同源基因，在阴道毛滴虫细胞的转录沉寂中可能发挥重要的作用。成功构建Tv一SIRZ一like原核表达重组子。为进一步进行Tv一SirZp一like蛋白质在模式生物阴道毛滴虫细胞内的亚细胞定位以及功能研究奠定基础。
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