环状RNA hsacirc0002360在肺腺癌中的临床意义及生物学机制

来源 :江苏大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:skyy2483
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背景及目的:环状RNA(Circular RNA)是呈现闭合环状构造的特别的非编码RNA。随着科学研究技术的发展越来越多的环状RNA被研究者们所发掘,相应地,关于它们的各种功能学研究也同步进行中。其中,环状RNA在肿瘤诊断及治疗的领域的研究就是现今的焦点之一。肺癌的发生率及死亡率居于高位,寻找有效的治疗及诊断手段迫在眉睫,因此其与肺腺癌关系的进一步探究逐步引起学者们的重视。本研究在于探讨hsacirc0002360在肺腺癌中的临床价值,为今后肺腺癌的诊疗提供新的研讨思路。方法:1.采集2018年1月到2019年9月期间在江苏大学附属人民医院胸外科住院行肺切除手术的肺癌患者组织标本,按照要求筛出122例患者纳入本次研究,术中取相应癌旁组织标本作为实验对照组;另外,收集其中50例患者术前及术后第二天的外周血液标本5ml,并采集50例门诊体检健康志愿者外周血5 ml。2.通过高通量测序技术检测肺腺癌组织较正常组织中含量具有显著差异的相关基因,筛选出环状RNA hsacirc0002360作为研究对象。通过PCR、琼脂糖凝胶电泳及Sanger测序等方法验证hsacirc0002360的环状结构,并且明确其成环位点。3.采取qRT-PCR法检测hsacirc0002360在肺腺癌组织、癌旁组织、外周血血清中的含量。配对t检验的统计学方法分析hsacirc00002360在人体标本中的差别;独立样本t检验测试肺癌患者hsacirc0002360的含量与患者本身临床特点的关系。4.运用miRanda数据库数据预测hsacirc0002360相匹配的microRNA,以及microRNA相匹配的mRNA;采取TCGA数据进行差别分析,筛选出hsacirc0002360、miR-762和mRNA PODXL作为后续研究对象;采取双荧光素酶基因法进一步验证的它们的靶向作用关系。5.采取qRT-PCR法检测人肺支气管上皮细胞株及肺腺癌细胞株中hsacirc0002360的表达情况,并选择含量较高的肺腺癌细胞株进行后续试验探究。应用Si-circ0002360转染肺腺癌细胞株降低hsacirc0002360的含量,Si-NC作为对照组;miR-762 inhibitor及miR-762 mimic转染肺腺癌细胞株分别降低及增高miR-762的表达量,并以其空载体miR-NC作为对照。设置实验分组为Si-circ0002360组、Si-NC组、Si-circ0002360+miR-762 inhibitor组、miR-762inhibitor组、miR-762mimic组及miR-NC组,运用CCK8、克隆形成实验、Transwell、划痕实验探究hsacirc0002360对肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响;Western blot检测上述分组的方式干预之后PODXL及上皮-间质转化相关蛋白的含量。结果:1.肺腺癌组织中hsacirc0002360的含量显著高于癌旁正常肺组织[(2.84±0.12)vs(1.46±0.08),P<0.01]。肺腺癌患者血液中hsacirc0002360的含量显著高于体检正常的健康志愿者[(2.59±0.17)vs(1.21±0.11),P<0.01]。肺腺癌患者术后血液中hsacirc0002360的表达水平较术前明显下降[(1.58±0.09)vs(2.59±0.17),P<0.01]。肺腺癌患者hsacirc0002360的含量高低与淋巴结转移(P=0.004)以及肿瘤分化程度(P=0.02)有一定相关性,与肿瘤患者的年龄、性别、吸烟史等无明显相关性(P>0.05)。2.与人肺支气管上皮细胞相比,人肺腺癌细胞株A549和H1975中目的基因显著高表达(P<0.05)。与对照组(Si-NC组)相比,降低hsacirc0002360含量后肺腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭水平显著降低(P<0.01)。3.双荧光素酶试验提示,hsacirc0002360WT(野生型)+miR-762组对荧光素活性的抑制率高于hsacirc0002360MUT(突变型)+miR-762;PODXL-WT(野生型)+miR-762组对荧光素酶活性的抑制率高于PODXL-MUT(突变型)。4.过表达miR-762后可减弱人肺腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力;下调miR-762可逆转由于hsacirc0002360含量降低所导致的人肺腺癌细胞株增殖、迁移及侵袭能力的减弱。结论:1.肺腺癌者hsacirc0002360显著高表达,其含量与肿瘤细胞分化程度及淋巴结转移相关。Hsacirc0002360有望成为肺腺癌诊断的分子标志物。2.降低hsacirc0002360含量可抑制人肺腺癌细胞株增殖、迁移及侵袭能力。Hsacirc0002360有望成为肺腺癌治疗的新的靶点。3.Hsacirc0002360可通过ceRNA机制促进肺腺癌进展,hsacirc0002360通过hsacirc0002360/miR-762/PODXL轴促进肺腺癌进展。
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