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背景与目的： 目前，在医院和社区获得性感染中，金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）有着较高的分离率。且随着内酰胺类药物的广泛应用，多重耐药的金黄色葡萄球菌不断涌现，最为严重的是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）产生。自从1961年首例耐药菌株被发现后，MRSA在世界各地均有所报道并呈显著性增长趋势。MRSA耐药谱极广，几乎可以水解所有的内酰胺类药物，且耐药菌株传播的速度很快。基于患者感染率和病死率高，医疗资源透支严重，病人、医院以及社会都面临沉重的经济负担，而且MRSA所致感染目前已成为世界上三大难解决感染性疾病之一，所以针对MRSA的研究也成为临床微生物界的热点。 基于MRSA的广泛耐药活性，及时明确菌株的耐药谱，对于合理指导抗感染治疗及严防耐药菌株的产生与流行，具有重要价值。由于各地抗菌药物使用习惯不同，不同地域MRSA菌株的耐药表型存在不同，故临床抗菌药物选择上存在差异，此点也是MRSA研究内容之一。万古霉素是治疗MRSA的重要手段。目前在河南地区尚未见到耐万古霉素菌株的报道。但有研究表明，MRSA的万古霉素MIC值有逐年增高趋势。河南地区是否存在此种变化，MRSA与MSSA之间万古霉素MIC是否有差异，对于临床万古霉素选择以及剂量制定意义重大。目前，我省尚无此方面的研究报道。 资料显示，MRSA的耐药机制是由于MSSA获得了SCCmec元件。SCCmec为一可移动性的遗传元件，其携带的mecA基因是导致MRSA耐药性产生的遗传基础。mecA基因通过编码PBP2a而实现对β-内酰胺类药物的耐药。研究表明，SCCmec元件有着多种型别，各型别之间因携带质粒或转座子上定位耐药基因不同，导致菌株耐药表型存在差异。对 MRSA进行分子分型，明确本地区流行SCCmec元件型别，是目前针对 MRSA研究的重要内容，其研究结果，在抗感染治疗中有着重要的指导价值。 为解决以上问题，我们设计本课题。旨在通过对2013年8月-2014年7月郑州大学第一附属医院细菌室分离的MRSA菌株检测研究，阐明河南地区临床分离MRSA菌株耐药生物表型，探讨MRSA与MSSA对万古霉素MIC值的分析，完成对MRSA菌株的分子分型，最终反映河南地区分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药现状，为治疗MRSA提供充分的实验室依据，便于临床从根本上控制MRSA的感染与传播。 方法： 1．菌株收集收集郑州大学第一附属医院细菌室2013年8月-2014年7月间，来自河南省不同地区的，门诊及住院患者各类标本分离出的非重复金黄色葡萄球菌325株。所有菌株均经VITEK-II全自动微生物分析仪鉴定至种。 2．体外药物敏感试验采用法国梅里埃药物敏感试验鉴定板及 VITEK-II全自动微生物鉴定分析仪完成药物敏感试验。特殊药物采用 K-B纸片法完成。结果参照美国临床和实验室标准协会2012版（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI2012）标准判断。实验以ATCC25923菌株作为质控菌株。 3．MRSA初筛试验以头孢西丁药敏纸片扩散法作为MRSA的初筛试验。结果判断标准：抑菌圈直径≥22mm为MSSA，抑菌圈直径≤21mm初筛为MRSA。 4．MRSA确证试验采用聚合酶链式反应检测mecA基因作为MRSA的确证试验，mecA基因阳性为判断MRSA的金标准。 5．万古霉素MIC检测采用E-Test试验完成MRSA菌株万古霉素MIC的检测。 6．MRSA与MSSA MIC差异性分析实验菌株分为MRSA组与MSSA组，以不同的万古霉素MIC浓度作为差异性分析的指标，采用秩相关进行统计分析，SPSS17.0软件分析统计结果，以P＜0.05为差异具有统计学意义。 7．基因组DNA的提取使用溶菌酶对MRSA菌株进行破壁处理后，严格按照磁珠法基因组DNA提取试剂盒操作流程，提取MRSA菌株基因组DNA，并采用紫外分光光度计检测所提DNA的浓度与纯度。 8．SCCmec基因分型采用多重PCR技术进行SCCmec基因分型。首先针对5种SCCmec基因型别保守片段设计特异性扩增引物，然后采用梯度PCR技术选择合适的多重PCR退火温度，之后对所有菌株进行分型检测。 9．pvl基因检测采用梯度PCR技术明确pvl基因检测最合适的退火温度，之后采用普通PCR方法对所有的MRSA菌株进行pvl基因的检测。 10．SCCmec基因型与生物表型关系分析选取不同SCCmec型别的MRSA菌株，进行体外液体稀释法抗菌药物敏感性试验，分析SCCmec基因型分型与抗生素体外药物敏感试验结果的相关关系。 结果： 1．所收集325株金黄色葡萄球菌主要来源于分泌物（39.4％），其次为痰液（31.7%）及血标本（12.3%）。 2．325株金黄色葡萄球菌中，MRSA180株（55.4%），MSSA145株（44.6%）。从标本来源看，MRSA主要来源依次为痰液（43.9%），分泌物（30.6%）及血标本（10.6%）；从科室分布来看，MRSA主要来自于ICU（32.8%）、呼吸内科（8.8%）、儿科（7.8%）、神经外科（7.8%）。 3．药敏结果显示，MRSA菌株对内酰胺类药物高度耐药，尤其对于青霉素及苯唑西林，耐药率达到100%。非β-内酰胺类药物耐药率也都超过50%。菌株对万古霉素、替加环素、利奈唑胺、替考拉宁等药物稳定敏感。 4．MRSA菌株的耐药率明显高于MSSA菌株，且两种菌株对万古霉素MIC值有显著性差异，MRSA高于MSSA。 5．SCCmec分子分型结果显示，所分离MRSA菌株中，SCCmecIII型为主要流行型别，共143株，占85.1%；其次为SCCmecII型12株，占7.1%；SCCmecV型较为少见，仅有3株，占1.7%；10株采用本实验方法未能进行分型，占5.9%。 6．168株MRSA中pvl基因阳性菌株30株，占17.9%。 7．药敏结果表明，SCCmecⅡ型、SCCmecⅢ型除了对β-内酰胺类药物广泛耐药外，还对喹诺酮类、大环内酯类、克林霉素、四环素具有较高的抗药活性；而SCCmecV型除β-内酰胺类药物耐药外，仅对红霉素、克林霉素、四环素耐药；所有菌株均对呋喃妥因、万古霉素、替加环素、利奈唑胺稳定敏感。 结论： 1．MRSA来源标本种类多，分布科室广泛，且万古霉素MIC值相对较高，提示临床应加强MRSA监测与防控工作，避免菌株进一步扩散传播。 2．河南地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以SCCmecIII型为主要流行菌株。建议临床抗MRSA感染治疗时，除慎用内酰胺类药物外，喹诺酮类、大环内酯类、克林霉素、四环素也应当合理应用。