论文部分内容阅读
目的:构建重组逆转录病毒pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-TCRVβ7.1,包装出病毒颗粒后感染PBMC,研究对肝癌细胞的杀伤作用,为以后TCR基因转染T细胞抗肿瘤研究打下基础。方法:主要包括三方面:1.逆转录病毒载体pLXPXSN-TCRα12-2-IRES- TCRVβ7.1的构建。以本实验室保存含TCRVβ7.1基因和TCRα12-2基因的质粒为模板,分别扩增得到两个基因,亚克隆入载体pLXPXSN,得到重组质粒pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1。2.重组逆转录病毒载体pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1的包装及鉴定。逆转录病毒载体pLXPXSN- TCRα12-2-IRES-Vβ7.1转染PA317细胞,包装出可同时表达TCRα12-2和TCRVβ7.1基因的重组逆转录病毒。病毒感染宫颈癌细胞(Hela),48小时后提取细胞总RNA,RT-PCR鉴定目的基因表达,提取细胞基因组DNA进行PCR鉴定;然后病毒感染PBMC,用流式细胞仪检测目的蛋白的表达,然后大量扩增病毒,测定滴度。3. MTT和流式细胞仪检测逆转录病毒载体pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染的PBMC对肝癌细胞的杀伤作用。用构建病毒和空载体病毒分别感染PBMC,感染后和未转染的PBMC分别作用于两株肝癌细胞BEL-7402和HepG2。48小时后用MTT和流式细胞仪检测杀伤效果。结果:酶切和测序结果证明逆转录病毒载体pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1构建正确并且包装成功。RT-PCR和流式细胞仪检测到基因TCRα12-2和TCRVβ7.1,表明目的基因可以有效的表达,病毒包装成功。重组逆转录病毒pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染PBMC组对肿瘤细胞的杀伤率明显高于单独使用PBMC组和空载体病毒感染PBMC组。结论:成功构建了逆转录病毒pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1重组载体。重组病毒感染PBMC后,流式细胞仪检测,表明TCRα12-2和TCRVβ7.1能够在宿主细胞中有效地表达。逆转录病毒pLXPXSN-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染后的PBMC可有效的杀伤肝癌细胞。