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研究背景和目的艰难梭菌(Clostridium difficile, CD)是一种革兰染色阳性、专性厌氧的粗大芽孢杆菌,在生存环境恶劣的情况下可形成次级端芽孢,主要在人与人之间通过粪口途径传播并定植于肠道。正常成人艰难梭菌无症状携带率为5-15%,住院患者可达57%,婴幼儿艰难梭菌携带率比成人高,可达84.4%。艰难梭菌是院内获得性腹泻的主要病原菌,也是社区获得性腹泻的重要致病菌。1978年,第一次发现了艰难梭菌与伪膜性肠炎(Pseudomembranous colitis. PMC)相关。正常情况下,艰难梭菌可存在于肠道中,并不致病。当长期大量应用广谱抗生素等原因造成肠道稳态失衡,艰难梭菌过度繁殖,引起艰难梭菌相关性感染(Closrtidium difficile infection, CDI)的发生,可导致艰难梭菌感染相关性腹泻(Clostridium difficile associated diarrhea, CDAD)。CDI是15%～25%抗生素相关性腹泻(Antibiotic-associated diarrhea,AAD)的病因,也是几乎所有抗生素相关性伪膜性结肠炎的病因。临床上大多数患者感染艰难梭菌后无症状,表现为健康携带者；出现临床症状者可表现为轻至重度水样泻、暴发性肠炎、伪膜性肠炎甚至感染性休克等全身症状。腹泻症状常出现于应用抗生素的过程中或是停用抗生素短期内,偶有停用数月后发病者。所有抗生素都可引起艰难梭菌感染,其中克林霉素、头孢菌素类和喹诺酮类引起的感染风险更高,而哌拉西林/他唑巴坦、替加环素等则很少引发CDI。目前CDI的标准治疗方案是使用甲硝唑或万古霉素,但高达25%的患者在使用这2种抗生素后30天内可出现复发,初次复发后再次复发率则可升高至40-65%。复发性CDI不仅难以治疗,而且会影响患者数月甚至数年,降低其生活质量,增加经济负担。由于广谱抗生素的滥用、高毒力菌株的出现、菌株耐药率增加等因素,CDI的发病率逐年升高,特别是在近期有住院史或是长期居住在照护机构的老年人群中。欧美国家曾多次发生爆发流行,流行期间病死率明显升高,导致医疗保健费用随之增加。为了更好地进行艰难梭菌感染发病机制的研究、疫苗的制备、新治疗方案的评价等,须建立稳定可靠的CDAD动物模型。仓鼠、豚鼠、无菌鼠、大鼠和小鼠都曾作为CDAD的模型动物。过去应用最广的是仓鼠模型,但由于仓鼠感染艰难梭菌后腹泻症状重,是一种暴发性、致死性的疾病过程。这与国内临床上人体感染艰难梭菌的常见结局不同,无法完全代表人类的感染过程。由于发现诱导小鼠易感性增加的新方法以及可应用于小鼠宿主组织分析的特异性试剂的改进等原因,近几年小鼠CDI模型的应用增加。Chen等发现经过混合抗生素±克林霉素诱导后,C57BL/6小鼠可成功感染艰难梭菌并出现腹泻,感染过程与人类相似,从而成为目前CDAD主要的模型动物。但我们前期研究发现应用本课题组临床分离菌株进行建模,C57BL/6模型鼠感染严重程度难控制,多数小鼠腹泻程度较轻,呈自愈性,可能限制其在难治性及复发性艰难梭菌感染研究中的应用。故本研究选择国内科研常用的3种品系小鼠,拟构建不同品系小鼠CDAD动物模型,并通过临床和病理指标对动物模型进行评估,筛选出最具临床代表性且稳定的动物模型,为艰难梭菌感染相关研究提供可靠的实验工具。粪菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)是指将健康人粪便中的功能菌群,移植到患者胃肠道内,重建具有正常功能的肠道菌群,从而达到治疗肠道及肠道外疾病的目的。近十年来,因为在治疗艰难梭菌感染方面疗效突出,粪菌移植受到国内外越来越多的关注。目前全世界已报道数千例应用粪菌移植的病例,这些病例中包括胃肠道疾病(如艰难梭菌感染、炎症性肠病、肠易激综合征等)和非胃肠道疾病(如疲劳综合征、特发性血小板减少性紫癜等)。粪菌移植治疗难治性艰难梭菌感染有效率可达80%-90%,并且相较于应用万古霉素等治疗方案,FMT疗程短、花费少、效果明显。2013年2月,美国食品及药品监督管理局将FMT写入CDI治疗指南中：建议在间歇性万古霉素治疗后第三次复发时,即可考虑使用FMT。虽然目前FMT已经用于多种疾病的临床治疗,但是FMT作为一项尚不完全成熟的临床治疗手段,其长期安全性问题,还缺乏足够的临床和实验室资料。最主要的不良反应包括嗳气、腹胀、腹部绞痛等消化道症状；而部分患者在FMT后可出现低热、腹泻增加等小肠细菌过度生长的症状,该症状多在FMT后3天内消失。此外,FMT更大的风险可能是基于肠道菌群的改变,诱发慢性病的发生。目前已知肠道菌群与一些疾病的发生相关,包括肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化、炎症性肠病、结肠癌、非酒精性脂肪肝、肠易激综合征、哮喘和自闭症等。改变宿主原有的肠道菌群结构,可能增加发生这些疾病的风险。目前还没有足够研究来证实FMT的安全性,本研究拟通过小鼠CDAD模型验证FMT治疗艰难梭菌感染的有效性,同时初步探索FMT对宿主行为活动、代谢、免疫等方面的影响,为评价FMT的安全性提供依据。研究方法和结果1.构建艰难梭菌感染小鼠稳定模型,挑选理想的模型动物选择南方医院临床分离菌株共50株进行复苏培养,通过观察菌落形态、镜下形态、乳酸脱氢酶检测、生化鉴定及毒素检测等方法鉴定。根据核糖分型,选择其中最为常见的作为本研究实验菌株。选择C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠,3种品系小鼠各24只,按随机分组原则分为4组(对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组),每组6只。实验组经抗生素诱导后,分别予以不同浓度(108CFU/ml～1010CFU/ml)的临床分离菌株混悬液灌胃,观察不同品系小鼠不同时间点腹泻、全身情况及结肠组织病理学变化。1.1.BALB/c小鼠腹泻症状呈细菌浓度依赖性低浓度组(108CFU/mL)中C57BL/6小鼠(n=6)未出现腹泻；BALB/c小鼠3只出现重度腹泻症状；KM小鼠1只出现轻度腹泻症状。中浓度组(109CFU/mL)中C57BL/6小鼠1只轻度腹泻；BALB/c小鼠5只出现重度腹泻症状,湿尾范围较其低浓度组稍大；KM小鼠4只出现不同程度腹泻,其中1只死亡,至观察终点存活率为83.3%。高浓度组(1010CFU/mL)中C57BL/6小鼠3只出现重度腹泻；BALB/c小鼠6只均出现腹泻,1只小鼠死亡,至观察终点存活率为83.3%；KM小鼠4只出现腹泻症状,未发现死亡。感染后小鼠平均体重下降明显,同时观察到小鼠活动度下降,毛发脱落,严重者出现弓背。1.2.腹泻小鼠粪便中分离出艰难梭菌随机选取3种腹泻小鼠粪便涂片、染色,可见不同程度肠道菌群失调及革兰阳性粗大芽孢杆菌。将腹泻小鼠粪便或肠内容物接种至CCFA-HT培养基厌氧培养并分纯,可见艰难梭菌典型菌落形态。核型分析证实小鼠粪便分离菌株核型与实验菌株一致。1.3.结肠病理评分与症状严重程度相关健康对照组0分,低浓度组中C57BL/6小鼠为0.3±0.5、BABL/c小鼠为1.5±0.5、KM小鼠为0.7±0.5,中浓度组中C57BL/6小鼠为0.7±0.5、BABL/c小鼠为2.0±0.9、KM小鼠为1.8±1.7,高浓度组中C57BL/6小鼠为1.0±0.6、BABL/c小鼠为3.2±1.2、KM小鼠为1.8±1.0。2.粪菌移植治疗小鼠艰难梭菌感染BALB/c小鼠共60只,按随机分组原则分为4组,每组15只。根据不同处理分为空白对照组、灌菌组、单次FMT组、3次FMT组,在3个时间点(FMT后1天、FMT后1周、FMT后1月)每组分别处死5只。建模前及每次处死前进行旷场实验。2.1.FMT治疗组腹泻小鼠减少,未出现死亡感染后,灌菌组小鼠5只出现轻度腹泻,10只出现重度腹泻,其中2只于灌菌后第3天死亡；单次FMT组小鼠5只出现轻度腹泻,无死亡；3次FMT组小鼠仅3只出现轻度腹泻。2.2.FMT能减轻小鼠肠道炎症2.2.1.抑制感染小鼠结肠缩短：灌菌组小鼠结肠长度缩短,肠腔充血、水肿。感染后第2天,灌菌组小鼠的结肠长度(8.5±0.46cm)显著低于空白组小鼠(10.9±0.30cm,p<0.01)、单次FMT组小鼠(9.5±0.64cm,p<0.01)及3次FMT组小鼠(10.1±0.72cm,p<0.01)。感染后第8天,灌菌组小鼠的结肠长度(8.4±0.24cm)仍显著低于空白组小鼠(11.5±0.41cm,p<0.01)、单次FMT组小鼠(9.8±0.48cm,p<0.01)及3次FMT组小鼠(10.5±0.73cm,p<0.01)。2.2.2.改善病变肠道炎症反应：灌菌组重度腹泻小鼠(d2),整个黏膜下层甚至固有层均可见炎性细胞,黏膜下层水肿且伴有上皮细胞的中断及脱落,肠腔内可见伪膜。FMT治疗后小鼠肠道可见部分被覆上皮脱落,邻近黏膜正常,黏膜下层可见少量炎性细胞,肠道炎症较灌菌组明显减轻。2.2.3.抑制肠道炎性细胞因子表达：治疗后1天,FMT组小鼠肠道不同炎性细胞因子表达量均较灌菌组明显降低(IL-1β(p<0.001)、IL-6(p<0.01)、TNF-α(p<0.05)),2个FMT组间无明显差异。治疗后7天,各组炎性细胞因子表达量均较治疗后1天下降,FMT组仍较灌菌组明显降低(IL-1β(p<0.001)、IL-6(p<0.01)、TNF-α(p<0.05))。治疗后1月,各组炎性细胞因子表达量无明显差异(p>0.05)。2.3.治疗后FMT组小鼠自主活动较空白对照组减少,焦虑水平无明显差异每只小鼠在实验开始前、实验终点2个时间点分别进行旷场实验。实验开始前,各组小鼠自主活动、焦虑水平无差异(p>0.05)；FMT治疗后1天,单次FMT组小鼠总运动路程、运动时间、边缘区路程、中央区路程较空白对照组减少(p<0.05)；治疗后1月,3次FMT组小鼠总运动路程(p<0.01)、运动时间(p<0.05)、边缘路程(p<0.01)较空白对照组减少,单次FMT组小鼠总运动路程(p<0.05)较空白对照组减少。2.4.治疗后各组代谢水平无明显差异FMT治疗后1天、7天、1月,FMT组小鼠血糖、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等指标较空白对照组、灌菌组均无明显差异(P>0.05))。结论1.以BALB/c小鼠为对象,予庆大霉素、甲硝唑、多粘菌素、万古霉素、卡那霉素混合抗生素溶液连续灌胃9天+克林霉素腹腔注射做预处理,24h后予10100CFU/ml细菌混悬液灌胃即可成功建立稳定的具有临床代表性的小鼠CDAD模型；2.治疗小鼠艰难梭菌感染时,增加粪菌移植次数未能明显增加疗效；3.粪菌移植治疗对小鼠行为活动、代谢水平无明显长期不良影响,可认为是一项安全有效的治疗手段。