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第一部分LncRNA EGOT在甲状腺癌中表达及功能目的:本部分主要研究LncRNA EGOT在甲状腺癌中的表达情况,以及其在甲状腺癌增殖及侵袭等表型中的作用。方法:收集附属肿瘤医院2015年1月到6月乳头状甲状腺癌组织,分别包括配对的癌组织、癌旁正常组织及腺外侵袭组织共四组,进行ce RNA芯片检测,生物信息分析筛选出侵袭性甲状腺癌中高表达lnc RNA,通过Q-PCR在组织内验证后,把相应的基因敲降后进行体外功能实验。结果:1.ce RNA芯片不但比对癌与正常组织,而且还比对了侵袭性甲状腺癌与癌组织、侵袭性甲状腺癌组织与正常组织差异,然后三组数据取交集,共筛到上调的LncRNA 15个,下调的39个。2.提取甲状腺癌肿瘤组织及配对正常组织以及侵袭性甲状腺癌组织,提取总RNA,QPCR结果证实LncRNA EGOT在癌组织相较正常组织,侵袭性癌组织相较于非侵袭性癌组织中均高表达,差异均具有统计学意义（P=0.0027,P=0.0312）。3.使用RNA探针进行FISH检测,发现LncRNA EGOT定位于细胞核与细胞浆,浆核分离实验也证明LncRNA EGOT浆核均有。4.用甲状腺癌细胞株转染siRNA敲降LncRNA EGOT后进行了克隆形成,CCK8,Transwell以及细胞划痕实验,发现敲降LncRNA EGOT后细胞增殖、侵袭等功能下降。结论:1.LncRNA EGOT在甲状腺癌中相较于正常组织,侵袭性癌组织较于非侵袭癌组织均高表达,预示着LncRNA.EGOT在甲状腺癌的增殖、迁移以及侵袭等表型中发挥一定的作用。2.LncRNA EGOT在临床样本中癌组织表达高于正常组织,侵袭性癌组织高于非侵袭性癌组织。3.LncRNA EGOT既存在与细胞核中,也存在细胞质中。4.LncRNA EGOT能够促进甲状腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭。第二部分LncRNA EGOT能与剪切因子QKI结合目的:本部分主要研究LncRNA EGOT在甲状腺癌中能够与QKI蛋白结合。方法:首先使用Hu ProtTM人类蛋白质组芯片与LncRNA EGOT杂交,筛选出最可能和LncRNA EGOT结合的蛋白,再通过Pulldown实验证实LncRNA与蛋白能够结合,最后通过RIP-PCR、RIP-sequence再次检验蛋白与LncRNA的结合,并且通过富集分析明确结合蛋白相关的功能及通路。结果:1.Hu ProtTM人类蛋白质组芯片与LncRNA EGOT杂交后,通过生信分析发现四个蛋白最可能和LncRNA EGOT结合,分别是QKI、RPUSD4、NFE2L2和MEX3B。2.Pulldown实验可以看到蛋白QKI可以和LncRNA EGOT正义链结合,和其反义链不结合,而蛋白RPUSD2既能和LncRNA的正义链结合,也能与其反义链结合,余下两蛋白与LncRNA正义链反义链均无明显结合。3.RIP-PCR证实QKI能够富集到LncRNA EGOT,RIP-sequence数据分析结果显示QKI能够结合较多m RNA,其中包括LncRNA EGOT。结论:1.蛋白芯片杂交实验筛选出LncRNA EGOT最有可能结合到QKI、RPUSD4、NFE2L2和MEX3B四个蛋白。2.LncRNA EGOT与QKI结合是特异性结合,与RPUSD4结合是非特异性,不能与NFE2L2和MEX3B两个蛋白集合。3.RIP-PCR及RIP-sequence均能够证明QKI可以与LncRNA结合。第三部分QKI在甲状腺癌中表达下调导致肿瘤增殖迁移表型增强目的:本部分主要研究LncRNA EGOT与QKI之间调节关系,QKI在甲状腺中表达情况以及在甲状癌的增殖、迁移等表型中的作用。方法:通过TCGA数据库的分析,明确QKI在甲状腺癌中表达情况以及其表达高低与临床分期、病理分型、侵袭等表型之间的关系。在甲状腺癌中敲降QKI后行转录组测序,通过生物信息学分析差异基因以及功能、通路富集,明确QKI在甲状腺癌中的主要功能,体外功能实验明确QKI在甲状腺癌中作用。结果:1.TCGA数据库中QKI表达值分析可以看出,其在多个癌中表达均低于正常组织,在甲状腺癌相对与正常组织中表达明显下调,在侵袭性癌组织中相对于非侵袭性癌组织也下调明显,且QKI与病理性肿瘤大小、病理性分期以及侵袭性等临床特征明显相关,通过免疫组化分析发现甲状腺癌组织中QKI蛋白表达下调。2.本文中所研究QKI为异构体QKI-5,免疫荧光检测显示QKI-5定位于细胞核。3.TPC-1细胞株转染siRNA后行转录组测序,共筛出差异基因81个,其中下调9个,上调72个,富集分析发现其与RIP-sequence结果以及在TCGA数据分析结果多条通路相同,比如细胞黏附,TNF信号通路,肌动蛋白细胞骨架等通路。4.在甲状腺癌细胞株分别敲降LncRNA及转染慢病毒过表达LncRNAEGOT后检测QKI m RNA和蛋白发现LncRNA负向调控QKI。结论:1.QKI在甲状腺癌组织中表达下调,其下调预示更大肿瘤,更严重的临床分期及侵袭性。2.QKI-5定位于细胞核。3.QKI下调后促进甲状腺癌增殖、迁移与侵袭。4.LncRNA EGOT负向调控QKI。第四部分剪切因子QKI调节ESYT2可变剪切抑制甲状腺增殖与迁移目的:本部分主要研究QKI作为剪切因子能够影响哪些基因的可变剪切,其在甲状腺癌中通过影响哪些基因从而发挥抑癌的作用。方法:QKI敲降后的转录组测序行可变剪切分析,筛选差异明显可变剪切事件,PCR验证可变剪切事件,Minigene实验明确QKI影响ESYT2的可变剪切,转染siRNA敲降ESYT2长转录本检测其在甲状腺功能。结果:1.QKI影响甲状腺癌中显著的事件535个,其中最多的事件为外显子跳跃（SE）。我们通过PCR验证了ESYT2、PLEKHM2及DEPDC与数据分析相符。2.Minigene实验证明过表达LncRNA EGOT,exon14的剪切下降,ESYT2L上调,过表达QKI则ESYT2的exon14剪切增多,ESYT2L下调。3.ESYT2L敲降后甲状腺癌增殖、迁移及侵袭能力下降。结论:1.QKI作为剪切因子,在甲状腺癌中能够影响多个基因的可变剪切。2.Minigene实验证明QKI可以影响ESYT2的可变剪切,主要影响ESYT2L的表达。3.敲降ESYT2L后甲状腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力下降。