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目的:临床研究显示糖尿病是革兰阴性杆菌感染的独立易感因素,同时糖尿病患者合并感染时临床表现更重,住院时间更长,住院花费更高,但其加重的原因和机制尚不清楚。以往的研究证实肺部感染时,感染组织局部会出现缺氧微环境。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）是一种低氧反应元件,在细胞组织氧浓度下降时激活,并激活一系列下游分子的转录及表达,既往研究表明HIF-1α参与感染的发生与发展。本研究通过观察在糖尿病小鼠肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae,K.P）肺炎中HIF-1α的水平变化在感染中的作用并探讨其机制,明确HIF-1α在糖尿病小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎中的作用。研究方法:1.探究糖尿病合并肺炎克雷伯杆菌肺炎的感染特点以及HIF-1α的表达情况将180只8周龄雄性C57bl/6小鼠（SPF级）随机分为:正常对照组、糖尿病非感染组、非糖尿病感染组,糖尿病感染组。对糖尿病非感染组和糖尿病感染组一次性空腹腹腔注射链脲佐菌素（STZ）150mg/kg进行糖尿病造模。利用无创气管插管技术,向非糖尿病感染组和糖尿病感染组接种K.P悬浊液20μl进行肺炎造模,向正常对照组及糖尿病非感染组接种等量无菌PBS。于0h（接种前）及接种后的2h,8h,12h,24h,2天,4天,5天,7天,通过小鼠一般状态、动物行为学指标、生存率、肺组织重量及病理、肺组织及脾组织细菌载量、血清细胞因子、肺泡灌洗液（BALF）细胞因子来评价感染和炎症反应。通过免疫印迹技术及免疫组织化学法对肺组织HIF-1α水平检测,比较四组之间上述指标差别。选取各组中24h时间点的小鼠（肺组织炎症反应最重）,流式细胞学检测小鼠BALF中巨噬细胞所占比例。2.HIF-1α在糖尿病小鼠合并肺炎克雷伯杆菌肺炎中的作用及可能机制探讨为明确HIF-1α作用,选取动物实验常用HIF-1α水解酶抑制剂二甲基草酰甘氨酸（DMOG）来明确抑制HIF-1α水解酶后对感染的影响。考虑到目前已上市的临床药物HIF-1α水解酶抑制剂罗沙司他（FG4592）所以单独设置一组动物应用罗沙司他,观察其对肺炎的影响。将270只8周龄雄性C57bl/6小鼠（SPF级）随机分为:正常对照组、糖尿病非感染组、非糖尿病感染组、糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组,糖尿病FG4592感染组。于感染前5天分别对糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组每两天一次腹腔注射DMOG（30mg/kg）和FG4592（10mg/kg）直至取材,其余模型建立同前。通过小鼠一般状态、动物行为学指标、生存率、肺组织重量及病理、肺组织及脾组织细菌载量、血清细胞因子、BALF细胞因子来评价感染和炎症反应。通过免疫印迹技术及免疫组织化学法对肺组织HIF-1α水平检测,比较各组之间上述指标差别。3.高糖低氧环境对小鼠巨噬细胞功能及细胞内HIF-1α的影响的初步研究选取小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）检测其对K.P清除能力。为衡量高糖对清除能力的影响,设置正常糖5.5m M和高糖30m M两个糖浓度,并分别加入200μM的DMOG、50μM的FG4592,24小时后加入K.P与细胞100:1共培养,本实验分为:5.5m M-K.P组、30m M-K.P组,30m M-K.P-DMOG组,30m M-K.P-FG4592组。随后进行菌落培养计数,比较各组巨噬细胞的清除能力。为衡量高糖及低氧对RAW264.7细胞HIF-1α水平的影响,对RAW264.7细胞进行低氧刺激（37℃、5%CO2、1%O2,6小时）。并加入200μM的DMOG、50μM的FG4592。为在体外模拟肺炎,加入K.P脂多糖（LPS,100ng/ml,24小时）。本实验分为:常氧正常糖组（N5）、低氧正常糖组（H5）、常氧高糖组（N30）、低氧高糖组（H30）、低氧高糖DMOG组（H30-DMOG）,低氧高糖FG4592组（H30-FG4592）,低氧正常糖LPS组（H5-LPS）、低氧高糖LPS组（H30-LPS）。通过免疫印迹技术进行HIF-1α水平检测。为衡量在体外高糖对肺炎时RAW264.7细胞增殖水平的影响,设置5.5m M和30m M两个糖浓度,并加入LPS模拟肺炎。分组:正常糖组（N5）、高糖组（N30）、正常糖LPS（N5-LPS）组、高糖LPS（N30-LPS）组、高糖DMOG-LPS组（N30-DMOG-LPS）。通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brd U）标记法进行细胞增殖能力检测。结果:1.糖尿病合并肺炎克雷伯杆菌肺炎的感染特点以及HIF-1α的表达情况1.1一般状态与生存率:相比糖尿病非感染组,糖尿病感染组小鼠活动量、食欲及体重明显减少（P<0.05）。仅糖尿病感染组出现眼角脓性分泌物、鼻流清涕等症状,其余三组无上述变化。糖尿病感染组2小时即出现死亡,非糖尿病感染组12小时起出现死亡。在7天的观察期结束时,糖尿病感染组生存率（67%）明显低于非糖尿病感染组（89%,P<0.05）。糖尿病非感染组和正常对照组均未出现死亡。1.2肺组织病理表现:相比正常对照组,糖尿病非感染组肺组织重量较轻（P<0.05）。相比非糖尿病感染组,糖尿病组感染组肺组织可见病变肺叶肿大更严重,质地变实范围更大,肺组织重量更重（P<0.01）。1.3石蜡切片HE染色光镜下表现:相比非糖尿病感染组,糖尿病组感染组光镜下可见更严重的毛细血管扩张和炎性细胞浸润及肺泡单位结构破坏,炎症细胞浸润程度评分显示,糖尿病感染组和非糖尿病感染组在感染后均迅速出现炎症浸润,糖尿病感染组在感染后约12小时至第4天炎症反应明显更重（P<0.05）。1.4 BALF细胞因子:相比正常对照组,糖尿病非感染组肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）均有升高（P<0.01）。相比非糖尿病感染组,糖尿病感染组小鼠的TNF-α显著升高（P<0.01）。1.5血清细胞因子:相比正常对照组,糖尿病非感染组TNF-α、IL-6均有升高（P<0.01）。相比非糖尿病感染组,糖尿病感染组TNF-α、IL-6均有显著升高（P<0.01）。1.6血清降钙素原（PCT）:相比正常对照组,糖尿病非感染组PCT升高（P<0.01）。相比非糖尿病感染组,糖尿病感染组PCT显著升高（P<0.01）1.7肺和脾组织匀浆菌落计数:相比非糖尿病感染组,糖尿病感染组肺组织全病程载菌量更高（P<0.01）,感染后4天仅糖尿病感染组在脾脏检测出K.P。1.8肺组织HIF-1α水平:相比正常对照组,糖尿病非感染组HIF-1α水平均有降低趋势但未达到统计学差异。相比正常对照组和糖尿病非感染组,糖尿病和非糖尿病感染组HIF-1α水平均有明升高,但糖尿病感染组升高的程度明显低于非糖尿病感染组（P<0.01）。1.9相比正常对照组,非糖尿病感染组和糖尿病感染组BALF中巨噬细胞占比更高（P<0.01）且为BALF中主要细胞（超过70%）。2.HIF-1α在糖尿病小鼠合并肺炎克雷伯杆菌肺炎中的作用及可能机制2.1一般状态与生存率:相比糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组一般状态改善,活动增加,眼角脓性分泌物减少,生存率改善显著（P<0.05）。2.2肺组织病理表现:相比糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组肺组织充血水肿情况减轻、实变范围缩小、肺组织重量减轻（P<0.05）。2.3石蜡切片HE染色光镜下表现:相比糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组肺组织HE染色炎症细胞浸润程度明显减轻（P<0.05）。2.4血清及肺泡灌洗液炎症因子检测:相比糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组血清及BALF中多种炎症因子水平显著降低（P<0.05）。2.5肺和脾组织细匀浆计数:与糖尿病感染组相比,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组细菌载量减少（P<0.05）。2.6肺组织HIF-1α水平:相比糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组小鼠肺组织的HIF-1α被激活（P<0.01）。3.高糖低氧环境下上调HIF-1α对巨噬细胞功能的影响3.1高糖条件下,受到低氧刺激的RAW264.7细胞的HIF-1α未能被正常激活。且与RAW264.7细胞共培养的K.P存活数量比正常糖条件下明显升高（P<0.01）。3.2高糖条件下,应用DMOG及FG4592后,高糖抑制的RAW264.7细胞HIF-1α水平可以被激活,与RAW264.7细胞共培养的K.P存活数量明显减少（P<0.05）。3.3高糖条件下,RAW264.7细胞经LPS刺激后增殖能力被抑制,应用DMOG处理后增殖能力增加（P<0.01）。结论:1.糖尿病会加重小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎感染的程度。主要表现为生存率低、肺组织及脾组织细菌载量高、血清及BALF炎症因子水平高。且糖尿病小鼠合并肺炎克雷伯杆菌肺炎时,HIF-1α升高的表达被抑制。2.通过过表达HIF-1α可以减轻糖尿病合并肺炎克雷伯杆菌小鼠的感染病情,提高生存率、加快细菌清除、减轻炎症反应。3.高糖低氧条件下HIF-1α能通过提高RAW264.7细胞对肺炎克雷伯杆菌的清除能力及恢复LPS激活的增殖功能改善高糖时RAW264.7细胞对感染的应答。